[發(fā)明專利]通過CAS9蛋白的多循環(huán)電穿孔產(chǎn)生的遺傳修飾的非人哺乳動物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780015504.2
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN109414001A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 王皓毅;W-B·王
• 申請（專利權(quán)）人: 杰克遜實驗室
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/87;C12N15/873
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;袁元

1.一種產(chǎn)生遺傳修飾的非人哺乳動物的方法，所述方法包括通過電穿孔將包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入非人哺乳動物的合子中以修飾所述非人哺乳動物的基因組，其中所述電穿孔包括4-10個循環(huán)。

2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述電穿孔包括4-8個循環(huán)，或6個循環(huán)。

3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述電穿孔的每個循環(huán)獨立地在20-40伏(例如，25-35伏、或30伏、或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35伏)下進行。

4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述電穿孔的每個循環(huán)獨立地使用1-2ms(例如，1.0或1.5ms)的脈沖持續(xù)時間進行。

5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述電穿孔的每個循環(huán)獨立地使用1-3個脈沖(例如，2個脈沖)進行。

6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述電穿孔的每個循環(huán)獨立地使用100-1000ms(例如，100ms或125-130ms)的脈沖間隔進行。

7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述電穿孔由6個循環(huán)組成，并且所述電穿孔的每個循環(huán)使用以下設置進行：30伏，1.0ms的脈沖持續(xù)時間，2個脈沖和100ms的脈沖間隔。

8.權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述Cas9蛋白在150-350ng/μL(例如，150ng/μL、200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL或350ng/μL)的最終濃度下進行電穿孔。

9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述CRISPR-Cas系統(tǒng)包含與所述非人哺乳動物的基因組中的靶序列雜交的單指導RNA(sgRNA)，并且其中所述sgRNA在300ng/μL(例如，200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL、350ng/μL或400ng/μL)的最終濃度下進行電穿孔。

10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中采用供體多核苷酸將所述Cas9蛋白電穿孔入所述合子中。

11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述供體多核苷酸是線性或環(huán)狀雙鏈DNA分子。

12.權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述非人哺乳動物的基因組通過一個或多個堿基對的插入或缺失、通過異源DNA片段(例如，所述供體多核苷酸)的插入、通過內(nèi)源DNA片段的缺失、通過內(nèi)源DNA片段的倒位或易位、或其組合而修飾。

13.權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中通過非同源末端連接(NHEJ)、同源定向修復(HDR)或同源重組(HR)來修飾所述非人哺乳動物的基因組。

14.權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述方法實現(xiàn)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高(例如，100％)的敲入(KI)效率。

15.權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述方法實現(xiàn)至少80％、85％、90％、95％、97％或100％的NHEJ效率。

16.權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述方法以至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或更高的比率在IVF(體外受精)產(chǎn)生的胚胎中實現(xiàn)至少1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb或更多的內(nèi)源基因組區(qū)域的缺失。

17.權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其中同時電穿孔多于一個合子。