[發(fā)明專利]用于納米孔測序的聚合酶-模板復(fù)合物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780014081.2
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN108699540A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A.阿耶;P.薩瓦鮑曼;C.施沃布;A.比比洛
• 申請（專利權(quán)）人: 吉尼亞科技公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12Q1/6869
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;黃希貴

1.用于制備聚合酶-模板復(fù)合物的方法，其包括：

（a）提供聚合酶；和

（b）將所述聚合酶與多核苷酸模板在包含0.8 μM-2.2 μM濃度的核苷酸且溫度為35℃-45℃的溶液中接觸，由此制備聚合酶-模板復(fù)合物。

2.權(quán)利要求1的方法，其還包括用所述聚合酶-模板復(fù)合物的聚合酶使溶液飽和。

3.增加模板-聚合酶復(fù)合物的持續(xù)性的方法，所述方法包括在包含0.8μM至2.2μM濃度的核苷酸且溫度為35℃-45℃的溶液中形成聚合酶-模板復(fù)合物，其中在高溫溶液中形成的所述聚合酶-模板復(fù)合物的持續(xù)性大于在室溫下由對照聚合酶-模板復(fù)合物溶液產(chǎn)生的持續(xù)性。

4.權(quán)利要求3的方法，其中形成聚合酶-模板復(fù)合物包括用所述聚合酶-模板復(fù)合物的聚合酶使溶液飽和。

5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其還包括在形成聚合酶-模板復(fù)合物后提高溶液中核苷酸的濃度。

6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶-模板復(fù)合物的聚合酶與如SEQ IDID: 14所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或更高的序列同一性或與其相同。

7.基于納米孔測序多核苷酸模板方法，所述方法包括：

在包含濃度為0.8μM至2.2μM核苷酸的溶液中形成聚合酶-模板復(fù)合物，所述溶液具有高溫；

將形成的聚合酶-模板復(fù)合物與納米孔組合以形成納米孔測序復(fù)合物；

向所述納米孔測序復(fù)合物提供標(biāo)記的核苷酸，以在35℃-45℃的高溫下起始模板的模板依賴性納米孔測序；

借助于所述納米孔，當(dāng)每種標(biāo)記的核苷酸與聚合酶結(jié)合時，在每種標(biāo)記的核苷酸的摻入過程中檢測與每種標(biāo)記的核苷酸結(jié)合的標(biāo)簽，從而確定多核苷酸模板的序列。

8.權(quán)利要求7的方法，其中形成聚合酶-模板復(fù)合物包括用所述聚合酶-模板復(fù)合物的聚合酶使溶液飽和。

9.權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶-模板復(fù)合物的聚合酶與如SEQ IDID: 14所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或更高的序列同一性或與其相同。

10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶與SpyCatcher 序列(SEQ ID NO:10)直接或間接連接。

11.制備聚合酶-模板復(fù)合物的方法：

（a）提供聚合酶；和

（b）使所述聚合酶與多核苷酸模板在包含濃度為至少100mM鹽且不含核苷酸的溶液中接觸，從而制備所述聚合酶-模板復(fù)合物。

12.增加模板-聚合酶復(fù)合物的持續(xù)性的方法，所述方法包括在包含濃度為至少100mM鹽且不含核苷酸的溶液中形成模板-聚合酶復(fù)合物；其中所述模板-聚合酶復(fù)合物的持續(xù)性大于當(dāng)在包含相同高濃度鹽且存在核苷酸的溶液中形成時的相同模板-多核苷酸復(fù)合物的持續(xù)性。

13.進(jìn)行模板依賴性DNA合成的方法，所述方法包括：

（a）在溶液中提供聚合酶-模板復(fù)合物，所述溶液包含至少100mM鹽的濃度且不含核苷酸；和

（b）通過向所述溶液中加入核苷酸來起始所述模板依賴性DNA合成。