[發(fā)明專利]pH響應(yīng)性熒光化合物和應(yīng)用其的線粒體自噬檢測用組合物及細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780012747.0
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN108699091B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 巖下秀文;坂本亮;石山宗孝
• 申請（專利權(quán)）人: 株式會社同仁化學(xué)研究所
• 主分類號: C07F9/6558
• 分類號: C07F9/6558;C09K11/06;C12Q1/02;G01N21/64;G01N21/77;G01N33/48
• 代理公司: 北京青松知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11384
• 代理人: 鄭青松

本發(fā)明公開一種在細(xì)胞內(nèi)線粒體上發(fā)生特異性局部化，在溶酶體中的弱酸性pH環(huán)境下呈現(xiàn)出強(qiáng)熒光發(fā)射，且不容易受到來自自體熒光(self?fluorescence)和細(xì)胞內(nèi)的其他熒光物質(zhì)的背景熒光的干擾的新的pH響應(yīng)性熒光化合物及應(yīng)用該化合物的線粒體自噬檢測用組合物以及細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬的檢測方法。該pH響應(yīng)性熒光化合物如下述通式所示，在通式中，L表示接頭，X表示藥學(xué)上允許的陰離子，Y表示可與線粒體蛋白質(zhì)上的官能團(tuán)共價結(jié)合的反應(yīng)性官能團(tuán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及新的pH響應(yīng)性熒光化合物和應(yīng)用該化合物的線粒體自噬檢測用組合物以及細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬的檢測方法。

背景技術(shù)

在細(xì)胞中，存在對于細(xì)胞內(nèi)廢棄的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器(organelle)等進(jìn)行再利用或代謝的分解過程，該過程被稱為自噬(autophagy：自食)。在該過程中，廢棄物質(zhì)被由脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成的被稱為自噬體(autophagosome)的隔離膜所覆蓋，并經(jīng)過與溶酶體(lysosome)融合而被分解。通過自噬進(jìn)行線粒體(mitochondrion)選擇性分解去除的機(jī)制，被稱為線粒體自噬(mytophagy)，起到使生物體對于與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病產(chǎn)生防御的作用。

作為檢測線粒體自噬的通常方法，可以列舉如下方法：溶解細(xì)胞，從得到的mRNA通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)確認(rèn)線粒體自噬相關(guān)因子的表達(dá)。由于該方法會破碎細(xì)胞，不能進(jìn)行活細(xì)胞成像(live cell imaging)。

作為細(xì)胞內(nèi)成像的代表性的方法，有如下方法：在線粒體中使被稱為Keima的pH響應(yīng)性熒光蛋白質(zhì)得以表達(dá)，并監(jiān)控來自Keima的熒光強(qiáng)度的方法(例如，參照非專利文獻(xiàn)1)。Keima的激發(fā)光譜(excitation spectrum)隨著pH發(fā)生變化。在中性環(huán)境下短波長側(cè)(440nm)呈優(yōu)勢，在酸性環(huán)境下長波長側(cè)(550nm)呈優(yōu)勢。對來自這兩個激發(fā)波長的圖像數(shù)據(jù)所得到的比值(Ratio)(550nm/440nm)圖像進(jìn)行觀察，可知在中性環(huán)境下Keima的比值變低，在酸性環(huán)境下Keima的比值變高。通過利用該現(xiàn)象，能夠從熒光圖像讀取伴有線粒體自噬的線粒體的pH變化，檢測出線粒體自噬。但是，由于該方法需要在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行Keima的表達(dá)，因此并不是可適用于所有細(xì)胞。

據(jù)此，作為能夠穿透細(xì)胞膜而被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，在線粒體上發(fā)生特異性局部化(localization)，并且發(fā)光強(qiáng)度會響應(yīng)線粒體的pH變化而發(fā)生變化的pH響應(yīng)性熒光色素，有人提出了下述化學(xué)式所示的化合物(參照非專利文獻(xiàn)2)。該化合物在分子內(nèi)包括：在線粒體上發(fā)生特異性局部化的三苯基膦基(triphenyl phosphonium groups)、具有pH傳感器功能的哌嗪(piperazine)環(huán)、可與線粒體蛋白質(zhì)共價結(jié)合的反應(yīng)性官能團(tuán)的氯甲基(chloromethyl group)、作為熒光生色團(tuán)的萘酰亞胺(naphthalene imide)。

[化學(xué)式1]

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1:

Kogure,T.,Karasawa,S.,Araki,T.,Saito,K.,Kinjo,M.,and Miyawaki,A.,Afluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitatesdual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy；NatureBiotechnology.24:577-581(2006).

非專利文獻(xiàn)2: