[發(fā)明專利]一種適用于超微量DNA測序的接頭及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780009071.X
• 申請日: 2017-05-27
• 公開（公告）號: CN108699554B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉妮;劉明;鐘果林;許明炎
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

本申請公開了一種適用于超微量DNA測序的接頭及其應(yīng)用。本申請的接頭從5’端到3’端依序包括Tag序列、PolyN序列、第一發(fā)夾互補序列、第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列、dUTP、第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和第二發(fā)夾互補序列；第二發(fā)夾互補序列為第一發(fā)夾互補序列的反向互補序列；并且，接頭的5’端具有磷酸化標記。本申請的接頭，在其中設(shè)計發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使用時，接頭自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后與待測DNA進行連接，這樣有效的避免了接頭在與待測DNA連接時的自連，從而避免了由此造成的連接效率低的問題。本申請的接頭特別適用于超微量DNA的文庫構(gòu)建和測序，為ctDNA的準確檢測奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及核酸序列領(lǐng)域，特別是涉及一種適合用于超微量DNA測序的接頭及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

21世紀，隨著DNA技術(shù)水平的提高，人類基因工程以及千人基因組計劃、癌癥基因組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。二代測序以其高通量和高速度的優(yōu)勢占據(jù)目前測序行業(yè)的大部分市場。主要的二代測序平臺有illumina、roche等。二代測序主要是邊合成邊測序的方法。目前使用的建庫方法中，采用Y字形接頭連接的方法引入待測DNA的兩端，通過傳統(tǒng)的PCR方法完成富集和擴增，這種傳統(tǒng)的接頭和連接擴增方法，容易造成二代測序額外錯誤率的發(fā)生。隨著基因工程的日益發(fā)展，對測序準確性和靈敏度的要求也越來越高。

此外，1947年，Mandel和Metais在血液、滑膜液和腦脊液等體液中，發(fā)現(xiàn)了一種胞外DNA，主要以DNA蛋白質(zhì)復合物或者游離DNA兩種形式存在。到了80年代，Leon等人研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血清DNA水平大大高于正常人。且研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到了與原發(fā)腫瘤一致的癌基因突變。這類存在在于腫瘤患者外周血清中的DNA被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，縮寫ctDNA)。ctDNA是腫瘤細胞體細胞DNA經(jīng)脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，可以被定性、定量和追蹤。因此，理論上只需要檢測患者的外周血液血漿中的ctDNA，即可簡單、方便的了解癌癥患者早期的基因突變信息，從而為癌癥的確診以及靶向用藥提供準確的參考信息。

但是，基于ctDNA的檢測技術(shù)并沒有得到廣泛應(yīng)用；其根本原因在于ctDNA在外周血液中的含量特別低。隨著腫瘤的疾病進展，ctDNA在血液中的含量也隨之升高。但是，就算對于晚期的癌癥患者而言，其ctDNA的含量也僅占總數(shù)的1％；早期的癌癥患者外周血中ctDNA的含量甚至少到0.01％。

目前的建庫方法主要是連接Y型接頭，Y型接頭在與待測DNA的連接過程中，易發(fā)生自連，尤其是在待測DNA微量的情況下。這種干擾會降低目的片段的連接效率，不利于含量低的ctDNA的基因檢測，影響檢測的準確性和特異性。因此，亟需一種能夠提高檢測準確性和特異性的技術(shù)，以解決ctDNA捕獲測序的技術(shù)壁壘。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的目的是提供一種新的特別適用于超微量DNA測序的接頭及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案：

本申請的一方面公開了一種適用于超微量DNA測序的接頭，接頭從5’端到3’端依序包括Tag序列、PolyN序列、第一發(fā)夾互補序列、第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列、dUTP、第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和第二發(fā)夾互補序列；所述第二發(fā)夾互補序列為第一發(fā)夾互補序列的反向互補序列；并且，接頭的5’端具有磷酸化標記。

其中，Tag序列用于進行定位，確定分子標記的起始位置，長度在3-4bp，所有接頭或者一類接頭中Tag序列都是相同的，固定不變；PolyN序列是一段6-12bp的隨機序列，用于進行單分子編碼，類似于接頭的唯一識別碼；第一發(fā)夾互補序列和第二發(fā)夾互補序列兩者的序列是互補的，在退火時兩者互補雜交，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；而第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列、dUTP和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列則是發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的環(huán)形部位，在連接靶標DNA片段后，建庫DNA擴增的引物就是針對第一發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和第二發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列設(shè)計的；dUTP的引入則是為了方便對接頭序列進行定位切割。