[發(fā)明專利]一種熊去氧膽酸的制備方法及其制備用酶2有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201780001726.9 | 申請日： | 2017-01-09 |
| 公開（公告）號： | CN107980064B | 公開（公告）日： | 2021-07-06 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉立輝;傅榮昭;劉滔滔;曹磊;彭亭 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳市邦泰綠色生物合成研究院 |
| 主分類號： | C12P33/02 | 分類號： | C12P33/02;C12N9/04 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 518102 廣東省深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)街道桃*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 熊去氧 膽酸 制備 方法 及其 | ||
本發(fā)明涉及一種利用生物酶催化技術(shù)制備熊去氧膽酸的方法及其制備用7β?類固醇脫氫酶。該方法以3α?羥基?7氧代?5β?膽烷酸為底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脫氫酶以及緩沖溶液存在的條件下，用7β?類固醇脫氫酶催化3α?羥基?7氧代?5β?膽烷酸制備熊去氧膽酸，其中7β?類固醇脫氫酶來源于腸球菌
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用生物酶催化技術(shù)制備熊去氧膽酸的方法及其制備用7β-類固醇脫氫酶。
背景技術(shù)
熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽的主要有效成分，具有增加膽汁酸分泌、并使膽汁成分改變、有利于膽結(jié)石中的膽固醇逐漸溶解、降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂等功效，主要用于治療膽石疾病。眾所周知，熊膽是一種非常稀缺的資源，原因在于其獲取的傳統(tǒng)途徑主要是依賴于人工養(yǎng)殖活熊取膽的方法。目前，這種周期長、收率低且不人道的傳統(tǒng)途徑逐漸被人工合成方法所取代。
起初，熊去氧膽酸的人工合成方法多為化學(xué)法，并且被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。但是化學(xué)法存在操作條件苛刻、選擇性低、污染環(huán)境、使用大量有機溶劑、存在有機溶劑殘留、有毒有害等缺點。為了解決化學(xué)法存在的諸多缺點，人們另辟蹊徑，尋找更好的生產(chǎn)途徑。中國發(fā)明專利申請CN105368828A公開了一種采用全細胞催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸熊去氧膽酸的方法，但是此種方法需進行細胞發(fā)酵培養(yǎng)，存在反應(yīng)時間長、操作繁瑣、產(chǎn)物復(fù)雜等缺點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種熊去氧膽酸的新的制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提到的現(xiàn)有制備方法所存在的有機溶劑殘留、條件苛刻、反應(yīng)時間長、操作繁瑣、污染環(huán)境等缺點，本發(fā)明同時提供了該新制備方法適用的生物酶。
為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人經(jīng)過長期大量的實驗摸索，在經(jīng)歷上百次的失敗嘗試之后，終于篩選出適用于細胞外生物催化制備熊去氧膽酸的生物酶，并在此序列基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，從而開發(fā)出一種新的制備熊去氧膽酸的方法，其特征在于：以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脫氫酶以及緩沖溶液存在的條件下，用7β-類固醇脫氫酶催化3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸制備熊去氧膽酸，所述7β-類固醇脫氫酶來源于腸球菌Enterococcus silesiacus，所述葡萄糖脫氫酶來源于巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium，其基因序列如SEQ ID NO：3所示，在整個催化反應(yīng)體系中，所述底物的濃度為50～100mg/mL，所述NADP的濃度為0.01～0.25mg/mL，所述葡萄糖的濃度為30～50mg/mL。
上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶液、固態(tài)以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。
優(yōu)選地，控制所述催化過程在溫度為25～35℃，pH值為7.5～8.5的條件下進行。
優(yōu)選地，所述緩沖溶液為50～100mM磷酸鉀緩沖液。
優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下提純步驟：待所述催化過程反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH值為10.5～12.5，除去不溶物，再調(diào)節(jié)pH值為1.0～2.0，水浴50-60℃，攪拌20～30min，待冷卻后過濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥即得熊去氧膽酸的成品。
更優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下精制步驟：將獲得的熊去氧膽酸的成品用10-20倍無水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，熱過濾，取濾液進行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入5-10倍純水?dāng)嚢?h進行結(jié)晶，過濾，將濾餅真空干燥，即得熊去氧膽酸的精制品。
優(yōu)選地，上述制備方法中所使用的7β-類固醇脫氫酶為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：
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