[發(fā)明專利]一種多器官細胞基因突變檢測基因編輯小鼠模型的構(gòu)建及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110690906.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113412820A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李海山;謝文平;沈國林;宋乃寧;趙潺
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/62;C12N15/55;G01N33/50
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11333
• 代理人: 劉俊玲

1.一種CD59基因編輯小鼠模型，它是定點敲入CD59-增強型綠色熒光蛋白(EGFP)表達序列片段的小鼠。

2.一種構(gòu)建CD59-EGFP基因編輯小鼠模型的方法，是利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠基因ROSA26位點定點敲入CD59-EGFP基因序列的方法，包括：設(shè)計并獲得向?qū)NA，制備向?qū)NA與Cas9蛋白混合物；構(gòu)建CD59-EGFP打靶載體；顯微共注射與F0代小鼠獲得，F(xiàn)1代小鼠獲得；所述的CD59-EGFP打靶載體中，CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建CD59-EGFP基因編輯小鼠模型的方法，具體包括如下步驟：

1)設(shè)計并獲得CD59-EGFP向?qū)NA；

2)將1)所得到的向?qū)NA與Cas9蛋白共同孵育，制備Cas9/向?qū)NA混合物；

3)構(gòu)建打靶載體，利用In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建CAG-Kozak-CD59-GS linker-EGFP-polyA同源重組載體，其中所述的CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

4)將2)得到的Cas9/向?qū)NA混合物和3)得到的打靶載體共注射到C57BL/6N小鼠受精卵的原核中，將注射后的所述受精卵移植入代孕母鼠中發(fā)育，出生后經(jīng)基因型鑒定篩出中靶小鼠，即F0代小鼠；

5)將4)中獲得的所述F0代小鼠中的性成熟小鼠與野生型C57BL/6N小鼠進行配繁得到F1代小鼠，經(jīng)基因型鑒定從F1代小鼠中篩出轉(zhuǎn)入了所述CD59-EGFP表達序列片段的雜合子小鼠，即得到可傳代繁育的CD59-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠。

4.權(quán)利要求2或3任意一項所述的構(gòu)建CD59-EGFP基因編輯小鼠模型的方法，其特征在于，所述的向?qū)NA的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.權(quán)利要求3所述的構(gòu)建CD59-EGFP基因編輯小鼠模型的方法，其特征在于，步驟4)和/或步驟5)所述的基因型鑒定的步驟包括：采用PCR檢測或測序驗證，提取小鼠尾基因組DNA，進行中靶后的PCR鑒定，引物序列如下：

6.權(quán)利要求5所述的構(gòu)建CD59-EGFP基因編輯小鼠模型的方法，其特征在于，所述的PCR鑒定中，采用序列如下的PCR引物，獲得較短片段PCR產(chǎn)物：

引物名稱	引物序列
F4	5’-TCAAGATCCGCCACAACATCG-3’(SEQ ID NO.10)
R4	5’-CTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGC-3’(SEQ ID NO.11)

。