[實用新型]線粒體耳聾A1555G突變的熒光定量PCR檢測試劑盒

有效

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• 申請日: 2017-06-28
• 公開（公告）號: CN207267881U
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設計）人: 舒強;尚世強;李偉;陶然
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6851
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 趙杭麗

技術領域

本實用新型屬分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及一種線粒體耳聾A1555G突變的熒光定量PCR檢測試劑盒。

背景技術

耳聾是全球關注的公共衛(wèi)生問題，由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，其中超過50％的耳聾患者由遺傳因素導致。在遺傳性耳聾中，30％為綜合征耳聾，70％為非綜合征耳聾。耳聾的遺傳方式可表現(xiàn)常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳和母系遺傳，線粒體DNA(mtDNA)突變是母系遺傳性耳聾發(fā)生的重要原因之一，在遺傳性耳聾中的發(fā)病率約為1％～2％。

位于mtDNA 12S rRNA上的A1555G突變是氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等的作用靶點，與藥物性耳聾的發(fā)生密切相關。該突變的主要致聾機制是人類mtDNA的第1555位核苷酸相當于細菌16S rRNA的第1491位核苷酸，當發(fā)生A1555G突變時，mtDNA 12S rRNA的A區(qū)能形成一個新的堿基配對，導致12S rRNA的二級結構與細菌16S rRNA對應部位的相似度更高，從而促進氨基糖苷類抗生素與之結合，結合后的氨基糖苷類抗生素會抑制參與氧化磷酸化過程的呼吸鏈蛋白的合成，使攜帶該突變的個體發(fā)生聽力損傷。總之，攜帶A1555G突變的個體對氨基糖苷類藥物具有超敏性，可引起臨床上常見的“一針致聾”現(xiàn)象，是藥物性耳聾發(fā)生的重要原因之一。

目前，mtDNA突變的常見檢測方法主要有直接測序法、微陣列芯片法、PCR-RFLP法、熒光定量PCR法等。直接測序法的優(yōu)點是準確性高，但檢測周期較長，且需要專業(yè)的測序儀和結果判讀人員，不適合臨床推廣應用。微陣列芯片法具有高通量的優(yōu)點，但存在檢測成本高、操作繁瑣、易交叉污染等缺點，不適用于大樣本篩查的需求。PCR-RFLP法由于在PCR擴增結束后需開蓋進行后續(xù)的酶切和電泳，同樣存在操作繁瑣、容易污染等問題。熒光定量PCR技術近年來在分子生物學領域的應用越來越廣泛，其基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎上設計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(R)和淬滅基團(Q)；探針保持完整時R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，Q基團的抑制作用消失，R基團的熒光信號就可被檢測到。該技術通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)對PCR過程中產物量的實時監(jiān)測，除具有定量準確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產物的后處理，避免了交叉污染。而且，隨著材料和儀器的進一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(FAM、HEX、ROX等)及多通道熒光定量PCR儀，可以實現(xiàn)基因分型、基因突變檢測、SNP分析等研究。

針對熒光定量PCR傳統(tǒng)Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，美國ABI公司于2000年推出一種新的Taqman探針——MGB探針，其3’端采用非熒光性的淬滅基團，在吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB探針的3’端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可極大提高探針與模板雜交的穩(wěn)定性，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值。而短探針的主要優(yōu)點在于熒光報告基團與淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，信噪比更高；同時，短探針也簡化了設計和降低了成本。有實驗表明MGB探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變。

發(fā)明內容

本實用新型的目的是提供一種線粒體耳聾常見突變A1555G的熒光定量PCR檢測試劑盒，由定量PCR反應液管、第一陽性對照品管、第二陽性對照品管、陰性對照品管、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液管設置24管矩陣排列，每個定量PCR反應液管含有PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴增引物序列為：5’-CATTTAACTAAAACCCCTACGCATTT-3’

下游擴增引物序列為：5’-GCACTTTCCAGTACACTTACCATGTT-3’

第一熒光探針序列為：5’-FAM-AGGAGGCAAGTCG-MGB-3’

第二熒光探針序列為：5’-HEX-TAGAGGAGACAAGTCG-MGB-3’

第一陽性對照品管為線粒體第1555位點為A堿基的DNA樣品，第二陽性對照品管為線粒體第1555位點為G堿基的DNA樣品，陰性對照品管為無菌注射用水樣品。

本實用新型試劑盒應保存于-20℃，盡量減少反復凍融。本實用新型試劑盒包括說明書和盒體。

本實用新型試劑盒使用方法：