[實(shí)用新型]新型多角度環(huán)狀光學(xué)照明顯微成像系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201720543615.8
• 申請日: 2017-05-17
• 公開（公告）號: CN206757171U
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許迎科;金璐紅;樊劍南;南迪;孫永紅;匡翠方;劉旭
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G01N21/64;G01N21/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200
• 代理人: 葉志堅(jiān)

技術(shù)領(lǐng)域

本實(shí)用新型屬于新型顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新型多角度環(huán)狀光學(xué)照明顯微成像系統(tǒng)。

背景技術(shù)

全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù)，該技術(shù)利用全內(nèi)反射時(shí)在介質(zhì)另一面產(chǎn)生的強(qiáng)度成指數(shù)衰減的倏逝波來激發(fā)位于倏逝場內(nèi)的熒光分子，以觀察用熒光標(biāo)記且靠近交界面極薄區(qū)域的樣品，觀測的動(dòng)態(tài)范圍通常在200nm以下，有效地控制了激發(fā)體積，大大降低了背景光噪聲干擾，能幫助研究者獲得高質(zhì)量的成像質(zhì)量和可靠的觀測數(shù)據(jù)。故此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。

環(huán)狀TIRF利用一個(gè)環(huán)狀光圈形成TIRF照明成像，它的優(yōu)勢在于減少了單點(diǎn)入射照明引起的干涉條紋，快速的多角度成像減少了3D成像以及單角度成像產(chǎn)生的色差，并提供了進(jìn)行圖像3D斷層重建的可能。

EPI指的是垂直式熒光顯微鏡。激發(fā)光以近乎垂直交界面的形式入射，使得進(jìn)入樣本區(qū)域的熒光強(qiáng)度仍舊非常強(qiáng)，可激發(fā)樣本上標(biāo)記出的全部熒光染料。

HILO(Highly inclined laminated optical)是在入射角將要進(jìn)入TIRF 時(shí)產(chǎn)生的，成像時(shí)噪聲比例非常小，信噪比可以達(dá)到EPI的數(shù)倍，非常適合觀察活細(xì)胞的活動(dòng)，但是與TIRF相比很難測定成像的深度，無法進(jìn)行定量分析。

目前市場上的商業(yè)全內(nèi)反射熒光顯微鏡并不具備能自由切換入射角度和 TIRF環(huán)狀照明及快速改變環(huán)大小的功能，也無法實(shí)現(xiàn)便捷的熒光成像模式轉(zhuǎn)換。在多色成像實(shí)驗(yàn)研究中，沒有考慮到不同波長的入射光在相同的入射角下產(chǎn)生的倏逝場的滲透深度不同，從而導(dǎo)致不同波長入射光下采集到的圖像包含不同深度的目標(biāo)這一問題，極大地干擾到后期的分析處理。另外，由于系統(tǒng)缺少具有4f的光學(xué)系統(tǒng)，無法保證近似完美的環(huán)狀TIRF照明，從而影響到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容

本實(shí)用新型提的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種新型多角度環(huán)狀光學(xué)照明顯微成像系統(tǒng)。

本實(shí)用新型解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：

本實(shí)用新型包括激光器、單模光纖、準(zhǔn)直透鏡、四分之一波片、4f二維掃描振鏡系統(tǒng)、聚焦鏡、二色鏡、TIRF顯微物鏡、樣品臺(tái)、濾波片、第二場鏡、探測器；

單模光纖、準(zhǔn)直透鏡、四分之一波片、4f二維掃描振鏡系統(tǒng)依次位于激光器出射光束的光軸之上，所述掃描振鏡系統(tǒng)包含兩個(gè)一維振鏡和兩個(gè)透鏡，兩個(gè)透鏡組成4f系統(tǒng)，兩個(gè)一維振鏡的反射面分為位于4f系統(tǒng)的共軛面上；聚焦鏡、二色鏡依次位于經(jīng)4f二維掃描振鏡系統(tǒng)射出光束的光軸上； TIRF顯微物鏡、樣品臺(tái)依次位于二色鏡反射光束光軸上，濾波片、第二場鏡、探測器依次位于二色鏡透射光束光軸上；所述樣品臺(tái)位于TIRF顯微物鏡的焦平面處，所述探測器的采集孔位于第二場鏡的焦平面處。

激光器發(fā)射的準(zhǔn)直激光光束，首先被導(dǎo)入單模光纖，從單模光纖射出的激光光束，經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡完成準(zhǔn)直；經(jīng)過準(zhǔn)直后的光束通過四分之一波片來調(diào)節(jié)，使其形成圓偏振光，之后入射到二維振鏡系統(tǒng)中，通過二維振鏡系統(tǒng)來控制入射光的偏轉(zhuǎn)角從而達(dá)到控制入射激光的入射角的目的，為了消除偽影現(xiàn)象，這個(gè)二維振鏡系統(tǒng)被安裝在4f系統(tǒng)的共軛面上，從而確保了入射光斑是一個(gè)完美的圓形，在多色成像的實(shí)驗(yàn)研究中，可以通過控制二維振鏡上的電壓值，使得在不同波長入射光下的TIRF場的滲透深度保持一致；二維振鏡系統(tǒng)的出射光，平行射出分別經(jīng)聚焦鏡和二色鏡的聚焦和反射后，聚焦于TIRF顯微物鏡并投射于樣品臺(tái)上的待測樣品之上；待測樣品所發(fā)射的信號光被TIRF顯微物鏡收集，先通過二色鏡透射后再依次經(jīng)過濾波片濾去雜散光，其次經(jīng)第二場鏡聚焦，最終被探測器采集，探測器記錄此時(shí)探測到的光強(qiáng)信號。

所述的4f二維掃描振鏡系統(tǒng)由兩面一維振鏡和組成4f系統(tǒng)的兩個(gè)等焦距透鏡組成，兩個(gè)一維振鏡的轉(zhuǎn)動(dòng)軸相互垂直，反射面嚴(yán)格位于4f系統(tǒng)的共軛面上，以保證環(huán)狀TIRF照明光斑維持一個(gè)完美的圓形。

本實(shí)用新型的有益效果如下：

(1)本實(shí)用新型能夠在EPI、HILO和TIRF之間快速切換顯微成像模式；

(2)環(huán)狀TIRF的實(shí)現(xiàn)提高了成像質(zhì)量，也彌補(bǔ)了不同波長激發(fā)造成的入射深度的差異，光源均一化有利于觀察細(xì)胞內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)；

(3)成像速度快，環(huán)狀TIRF掃描形成時(shí)間在10ms左右，不影響細(xì)胞觀察；

(4)對實(shí)驗(yàn)條件無特殊要求，普適性好，操作方便。