[發明專利]一種擴繁家蠶核型多角體病毒的方法

在審

• 申請號: 201711500879.6
• 申請日: 2017-12-18
• 公開（公告）號: CN108220250A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 蔡國祥;林水中;劉桂州;茆迎春;楊俊生
• 申請（專利權）人: 蔡國祥
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種擴繁家蠶核型多角體病毒的方法，包括毒源病毒的制備、病毒的臨時保存病毒的人工接種、病毒的采收幾個步驟，接種病毒前首先對毒源病毒提純，病毒的臨時保存方法為病毒多角體配制成1.2×10⁴個/毫升～1.4×10⁴個/毫升濃度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌靈1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室溫條件保存1～2小時，接種病毒的時間選擇為家蠶五齡餉食后4～8小時，接種病毒后90～100小時采收病毒。本申請提供的擴繁家蠶核型多角體病毒的方法，生產工藝簡單，生產成本低，擴繁效益高，對環境的要求也低，是生產家蠶血液型膿病滅活疫苗首選的病毒擴繁方案。

技術領域

本申請涉及一種擴繁家蠶核型多角體病毒的方法，屬于滅活疫苗制備技術領域。

背景技術

滅活疫苗是指先對病毒或細菌進行培養，然后用加熱或化學試劑(通常是福爾馬林)將其滅活，從而得到的疫苗。目前，國內使用的滅活疫苗有百白破疫苗、流行性感冒疫苗、狂犬病疫苗和甲肝滅活疫苗等，在家畜及家禽生產方面，研發的滅活疫苗更是不計其數，為控制傳染性疾病的流行，發揮了重要的作用。生產上病原的擴繁，一般采用先行繁殖宿主活體細胞，然后再人工接種病原，等到宿主細胞形態發生顯著變化后再收獲病原，因此，病原的大規模擴繁是滅活疫苗生產的前提條件。

家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒侵染引起的急性傳染病，生產上，其發病急，傳染快，損失大，一般可引起20％左右的產量損失，重災農戶甚至可導致顆粒無收。對家蠶血液型膿病的防治，目前主要采用的以消毒防病為主的預防措施，也有科研部門研發其滅活疫苗，取得了一些進展。對于家蠶核型多角體病毒，中國專利CN1410541A公開了可用克隆的昆蟲卵巢細胞進行擴繁，存在著生產場所條件要求高，生產工藝繁雜，生產成本高的缺陷，直接進行家蠶活體接種進行病毒擴繁，成為優先采用的手段。在用教科書《蠶病學》(浙江省嘉興農業學校主編，農業出版社，1995年5月出版)中公開的方法進行人工接種擴繁病毒時，存在著家蠶細菌性病害發病率高、真菌性病害發病率高、病毒性病害發病率低的現象，進而導致擴繁效率低下。本發明提出了一種新的家蠶核型多角體病毒的人工擴繁方法，旨在為進一步研發家蠶血液型膿病滅活疫苗打下基礎。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，采取的技術方案是：

一種擴繁家蠶核型多角體病毒的方法，包括毒源病毒的制備、病毒的臨時保存、病毒的人工接種、病毒的采收幾個步驟，其特征是：病毒的臨時保存方法為病毒多角體配制成1.2×10⁴個/毫升～1.4×10⁴個/毫升濃度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌靈，1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室溫條件保存1～2小時。

進一步的優選方案是：病毒的保存方法為病毒多角體配制成1.3×10⁴個/毫升濃度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌靈，1∶1∶1的配比，25℃室溫條件保存1.5小時。

所述毒源病毒的制備包括以下步驟：病蠶收集、研磨、雙層紗布過濾、離心提純，具體為，病蠶的收集為選取家蠶血液型膿病典型癥狀的體節腫脹，血液呈乳白色的蠶兒，經1％有效氯漂白粉水溶液體表消毒后放入粉碎機中，加入等量的無菌水磨碎，再后用雙層紗布過濾，濾去雜質，濾液移入離心機中，3500轉/分的轉速離心5分鐘，倒掉上層澄清液，取下層沉淀，加入5倍的無菌水混合均勻，再離心5分鐘，再倒掉上層澄清液，取下層沉淀，再加入5倍的無菌水混合均勻，再離心5分鐘，倒掉上層澄清液，最后顯微鏡檢查多角體密度，配制成1.2×10⁴個/毫升～1.4×10⁴個/毫升濃度備用。

所述病毒的人工接種方法為穿剌接種，接種時，取接種針先進行酒精燈火焰灼燒消毒，再用接種針醮取病毒臨時保存液，沿與家蠶身體長度平行方向，從倒數第二腹節的節間膜處，由后往前，剌穿家蠶體壁，接種時間選擇在家蠶五齡餉食后4～8小時。