[發明專利]弓形蟲核酸快速檢測引物組、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 201711497727.5
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN107916296A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 胡振新;譚卓;郜安國
• 申請（專利權）人: 蘇州點晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司32232
• 代理人: 何蔚

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種弓形蟲核酸快速檢測引物組、試劑盒和檢測方法。

背景技術

弓形蟲(Toxoplasma gondii)呈全球性分布、幾乎感染所有恒溫脊椎動物的細胞內寄生原蟲，導致嚴重的人獸共患病。全世界約有1/4的人口感染弓形蟲，我國人群平均感染率為7.9％，犬、貓等寵物感染弓形蟲也非常普遍，可造成動物流產或感染后不發病而成病原攜帶者，成為人類感染弓形蟲病的重要傳染源。對于免疫抑制患者、免疫功能受損及缺陷患者，弓形蟲感染最常見的表征是先天感染中發生的脈絡膜視網膜炎以及像晚期AIDS等免疫缺陷患者發生的腦炎。孕婦感染后，則會造成畸胎、死胎或引發嬰兒先天性弓形蟲病，危害較大。

據統計，1985-2006年期間，我國犬弓形蟲感染率在0.66％-62.3％之間不等，貓弓形蟲感染率在14.06％-78％，常形成局部暴發流行。嚴重影響畜牧業發展且威脅人類健康。

傳統弓形蟲檢測方法主要有：直接涂片或組織切片法、組織培養法、動物實驗法、酶聯免疫吸附等。直接涂片或組織切片法雖然簡單快速，但漏診率高；組織培養和動物實驗最真實可靠，但操作煩瑣，耗時長，成本高；酶聯免疫吸附法簡便，快速，敏感性尚可，但由于個體免役系統的差異，有時指標不能真實反映蟲體感染的情況，可能造成漏診或誤疹。

目前，已有少數針對弓形蟲核酸的檢測方法，主要包括PCR技術和實時熒光定量PCR技術，對弓形蟲的檢測靈敏度和特異性有了很大提升。但PCR技術和實時熒光定量PCR技術均涉及變溫步驟，或較高溫度，這需要提取DNA的步驟，且需要配備價格高昂的PCR儀或實時熒光定量PCR儀，耗時較長、操作技術要求較高。目前分子診斷行業的發展趨勢是實現簡單、快速、準確、高靈敏度的檢測。

中國專利CN201610867186.X，公開了一種弓形蟲核酸的快速檢測方法及其快速檢測試劑盒，其所述檢測方法需要另外進行核酸提取步驟，且檢測步驟較為復雜，容易造成氣溶膠污染，引入假陽性風險。

發明內容

本發明的目的是提供一種弓形蟲核酸快速檢測引物組、試劑盒和檢測方法，特異性強、準確率高，操作簡單、時間短、儀器要求低，能夠實現快速、準確、低成本地檢測弓形蟲。

為達到上述目的，本發明的技術方案是：弓形蟲核酸快速檢測引物組，包括檢測弓形蟲基因組B1基因序列的上、下游引物和探針；

所述上游引物是：5’-TTGCTGTTCTGTCCTATCGC-3’；

所述下游引物是：5’-ATGTTGCATTCTTCAGCCGTCT-3；

所述探針是：TCCCATGAAGTCGACCACCTGTTTCCTC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1d T/TCACTGTCA-C3 Spacer。其中：“i6-FAMdT”是6-FAM(6-羧基熒光素)熒光標記的dT核苷酸，“idSp”指堿基缺失，“iBHQ1dT”是帶有BHQ1淬滅基團標記的dT核苷酸，“C3Spacer”指3’羥基封閉。

所述上、下游引物和探針可以是與權利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探針是與權利要求1所述序列堿基互補的序列。

本發明還提供弓形蟲核酸快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括以下內容：

(1)裂解液；

(2)稀釋液；

(3)含引物的凍干酶管；所述引物為檢測弓形蟲基因組B1基因序列的上、下游引物和探針；

所述上游引物是：5’-TTGCTGTTCTGTCCTATCGC-3’；

所述下游引物是：5’-ATGTTGCATTCTTCAGCCGTCT-3；

所述探針是：TCCCATGAAGTCGACCACCTGTTTCCTC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1d T/TCACTGTCA-C3 Spacer；

(4)陽性對照品；

(5)陰性對照品。

其中，所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含0.1-2M的KAc 100ul、0.1-2M的KOH 120ul、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 250ul、水30ul。

優選的，所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含1.5-2M的KAc100ul、0.5-1M的KOH 120ul、1-2M pH8.0的Tris-Ac 250ul、水30ul。