[發(fā)明專利]一種改進(jìn)的啟動(dòng)子及其組成的T載體和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711490304.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108165551B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛高旭;賈延凱;齊甜銘;馮愛(ài)華;謝正立;吳昕;孫中平;廖國(guó)娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種T載體，其特征在于，所述T載體為將克隆載體制備成線性化載體后，在所述線性化載體的3’端添加1個(gè)雙脫氧胸腺嘧啶核苷酸得到；

所述克隆載體包括改進(jìn)的啟動(dòng)子；

所述改進(jìn)的啟動(dòng)子為將β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子區(qū)域中的-35區(qū)至-10區(qū)之間的核酸序列突變?yōu)楹怂醿?nèi)切酶酶切形成平末端序列的識(shí)別位點(diǎn)；

所述β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子區(qū)域中的-35區(qū)至-10區(qū)之間的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

所述核酸內(nèi)切酶為EcoRV或PmlI；

所述改進(jìn)的啟動(dòng)子的-35區(qū)至-10區(qū)之間的核酸序列如SEQ ID NO.3-10所示；

所述克隆載體上的lacZα基因替換為對(duì)宿主有毒性的基因，所述對(duì)宿主有毒性的基因?yàn)閏cdB基因，所述ccdB基因的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述克隆載體為pUC57、pCK或pCC1中的任意一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T載體，其特征在于，所述克隆載體還包括lacI表達(dá)元件，所述lacI表達(dá)元件可操作地連接在所述載體上；

所述lacI表達(dá)元件的核酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的T載體，其特征在于，所述T載體還包括外源基因，所述外源基因可操作地連接在所述改進(jìn)的啟動(dòng)子的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。

4.一種如權(quán)利要求3所述的T載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將對(duì)宿主有毒性的基因替換載體上的lacZα基因；

(2)根據(jù)要突變的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以原啟動(dòng)子及其調(diào)控表達(dá)的基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有改進(jìn)的啟動(dòng)子的產(chǎn)物；

(3)用Gibson重組的方法將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)化，得到帶有啟動(dòng)子的載體；

(4)將步驟(3)所述載體進(jìn)行線性化，在所述線性化的載體的3’端添加1個(gè)雙脫氧胸腺嘧啶核苷酸，得到所述T載體；

步驟(2)所述引物的核酸序列如SEQ ID NO.13-28所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述線性化為核酸內(nèi)切酶酶切和/或PCR擴(kuò)增獲得。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述添加1個(gè)雙脫氧胸腺嘧啶核苷酸采用末端轉(zhuǎn)移酶和/或Taq DNA聚合酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)之前還包括將對(duì)宿主有毒性的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)之后還包括向所述載體上插入外源基因。

9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包括如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的T載體。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為野生型大腸桿菌。

11.一種基因克隆的方法，其特征在于，包括如下步驟：

將外源基因的3’端添加1個(gè)A堿基，添加A堿基的外源基因與權(quán)利要求1或2所述T載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，在合適的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以便獲得陽(yáng)性克隆。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為野生型大腸桿菌。

13.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的T載體或權(quán)利要求9或10所述的宿主細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于基因克隆。