[發(fā)明專利]一種改進的啟動子及其組成的T載體和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711485271.0
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108060168B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛高旭;謝正立;馮愛華;齊甜銘;賈延凱;吳昕;孫中平;廖國娟
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種改進的啟動子及其應(yīng)用，所述改進的啟動子為將啟動子區(qū)域中的?35區(qū)至?10區(qū)之間的核酸序列突變?yōu)楹怂醿?nèi)切酶識別位點。本發(fā)明能夠克服由于采用藍(lán)白篩選的載體存在強啟動子啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物可能對宿主有毒性而導(dǎo)致無法克隆的問題，可以避免載體在酶切位點缺失1?2bp導(dǎo)致lacZα基因移碼突變產(chǎn)生假陽性克隆的缺陷，可以消除由于外源DNA片段較小并且外源DNA的插入沒有改變lacZα基因的讀碼框，造成平板都是藍(lán)斑的假陰性現(xiàn)象。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種改進的啟動子及其組成的T載體和應(yīng)用，具體涉及一種改進的啟動子、帶有所述改進啟動子的T載體，帶有所述T載體的宿主細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

PCR技術(shù)的發(fā)明是分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域的重大突破。PCR技術(shù)誕生之后，將PCR產(chǎn)物克隆入載體(通常為質(zhì)粒)的技術(shù)也獲得發(fā)展。常用且相對簡單的克隆方法包括TA克隆和平末端連接。由Taq酶擴增出的PCR產(chǎn)物含有dAMP尾巴，在T4連接酶的作用下，可以和含有T末端的載體(T載體)連接，這就是TA克隆。而高保真DNA聚合酶通常含有3’-5’核酸外切酶活性，它們擴增出的PCR產(chǎn)物為平末端，將這些片段與切成平末端的載體在T4連接酶的作用下連接就是平末端連接。這兩種方法的共同特點是不需要事先用特殊的酶對PCR產(chǎn)物進行處理，而是直接連入載體，具有簡單易操作的特性。

目前商業(yè)化的T載體和可以用于平末端克隆的載體通常是基于藍(lán)白斑篩選的原理，藍(lán)白斑篩選是最常用的將空載體和有插入片段的載體相分開的一種篩選方案。在這種方法中，報告基因LacZα作為藍(lán)白斑篩選的標(biāo)記基因，然而基于藍(lán)白斑篩選原理的載體在克隆時有以下問題：(1)由于使用強啟動子，能夠大量啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，導(dǎo)致了某些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源基因轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物對宿主有毒性而無法克隆；(2)酶切載體時由于限制性內(nèi)切酶殘留的外切酶活性、酶切載體的反復(fù)凍融以及酶切線性化載體的長期保存等因素使得制備的載體在酶切位點缺失1-2堿基，導(dǎo)LacZα基因的移碼突變，使得不含外源基因的克隆由于LacZα基因的移碼突變而顯白色，導(dǎo)致產(chǎn)生大量假陽性克隆；(3)在克隆外源DNA小片段并且外源DNA的插入沒有改變lacZα基因的讀碼框時會造成平板都是藍(lán)斑的假陰性現(xiàn)象；(4)載體在平末端克隆大于2kb的外源DNA片段時，白斑會很少，而藍(lán)斑卻很多，而且本來就很少的白斑還可能與藍(lán)斑長在一起，使得白斑單克隆極少，挑選足夠數(shù)量的陽性克隆會很困難。此外，藍(lán)白斑篩選還需要用到X-gal和IPTG等昂貴且有毒性的化學(xué)物質(zhì)。

CN 101503698 A公開了一種無假陽性T載體及制備方法，所述T載體是一種兩個3’端均具有1個突出的dT的線性化質(zhì)粒載體，所述T載體供插入3’端突出一個dA的PCR片段的位點，即線性化T載體的兩個末端，位于陽性克隆篩選標(biāo)記基因起始密碼子與其上游的核糖體結(jié)合位點之間，該發(fā)明設(shè)計構(gòu)建的T載體在用于克隆PCR片段時，不會因為T載體自連導(dǎo)致的陽性克隆篩選標(biāo)記基因移碼而產(chǎn)生假陽性克隆。但是，如果插入片段不是很長、序列含有ATG起始密碼子，并且ATG起始密碼子與插入位點上游的RBS距離在8±3bp范圍內(nèi)，就會從插入序列的起始密碼子開始進行翻譯，如果翻譯的ORF和篩選基因的ORF一致，就會融合表達篩選基因，這樣就會產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象，不僅如此，其不能避免外源基因的轉(zhuǎn)錄，會出現(xiàn)強啟動子啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物對宿主有毒性而導(dǎo)致無法克隆的問題。

任何一段能夠獨立與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列都可以被稱為啟動子。在啟動子中，能夠被σ因子識別的區(qū)域具有非常保守的序列特征。其中，在轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)上游大約10nt以及35nt處的兩段序列(稱為-10區(qū)與-35區(qū))對于σ因子的識別具有決定性的作用，因此這兩段序列也被稱作狹義啟動子或核心啟動子。除這段核心啟動子區(qū)域之外，-35區(qū)的上游序列也可能對轉(zhuǎn)錄的強度產(chǎn)生影響，這些序列被稱作UP元件(UPelement)。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中制備的T載體無法克隆，或產(chǎn)生大量假陽性或假陰性克隆，從而提供一種改進的啟動子及其組成的T載體和應(yīng)用。