[發明專利]一種反芻專用復合微生態制劑的制備方法

在審

• 申請號: 201711482500.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108220190A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 鐘誠;盧永輝;胡夢毅
• 申請（專利權）人: 山東高龍生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/16;C12N11/14;A23K50/10;A23K10/18;C12R1/125;C12R1/10;C12R1/07;C12R1/865
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 倪鉅芳

1.一種反芻專用復合微生態制劑的制備方法，其特征在于：包括如下具體步驟：

第一步，菌種活化：

將4℃斜面保存的芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母活化，將其分別劃線于相應固體培養基上，25-37℃，培養20-48h；

第二步，種子培養：

挑取活化的菌落，將各菌株接種于各自種子培養基進行種子培養，25-37℃、200r/min培養18-24h；

第三步，上罐發酵培養：

將一級種子液按5-10％接種量接入一級400L發酵罐中，發酵培養基為下述培養基，通風比1:1，轉速100r/min，25-37℃，培養8h后轉入5t二級發酵罐，培養16h后轉入70t三級發酵罐，培養24h后收集菌液；

第四步，提取干燥：

①將收集后的芽孢桿菌菌液添加碳酸鈣5％-7％，磷酸二氫鈉2％-3％，氯化鈣2.5-3％絮凝劑絮凝。然后使用孔徑為500目的濾布進行板框過濾，收集濾餅。將濾餅進行低溫干燥(60-80℃)，烘干后粉碎，制得菌粉；

②將收集后的嗜酸乳桿菌加入5％海藻糖保護劑進行真空冷凍干燥，收集菌粉；

③將收集后的釀酒酵母加入7％蔗糖保護劑進行真空冷凍干燥，收集菌粉；第五步，稀釋涂布平板計算活菌數：取1g各單菌菌粉進行稀釋涂布平板計算活菌數。

第六步，混合：

將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母按照一定比例復配，以麥飯石為載體，進行混勻制得復合微生態制劑。

第七步，包裝：

采用無菌密封袋包裝復合微生態制劑。

2.根據權利要求1所述的一種反芻專用復合微生態制劑的制備方法，其特征在于：所述的第一步中，

所述芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌；

所述芽孢桿菌的固體培養基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂18，pH 7.2；

所述嗜酸乳桿菌的固體培養基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，磷酸氫二鉀2，乙酸鈉5，葡萄糖20，吐溫801mL，檸檬酸二銨2，硫酸鎂0.58，硫酸錳0.25，瓊脂18，pH 6.2；

所述釀酒酵母的固體培養基(g/L):酵母浸粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂18，pH 6.2；

菌種來源：

枯草芽孢桿菌：中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號10071；

地衣芽孢桿菌：中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號10037；

凝結芽孢桿菌：中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號21736；

嗜酸乳桿菌：中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號6074；

釀酒酵母：中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號31015。

3.根據權利要求1所述的一種反芻專用復合微生態制劑的制備方法，其特征在于：所述的第二步中，

所述芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母種子培養基同第一步固體培養基，只是不加瓊脂。

4.根據權利要求1所述的一種反芻專用復合微生態制劑的制備方法，其特征在于：所述的第三步中，

所述芽孢桿菌的發酵培養基(g/L):蛋白胨30-50，酵母浸粉25-40，葡萄糖3-5，氯化鈉0.4-1，玉米淀粉2-4，玉米漿干粉2-3，豆餅粉4-5，碳酸鈣1-1.5，磷酸氫二鉀5-10，硫酸鎂1-2，中性蛋白酶10-20，中性淀粉酶5-10，硫酸錳2-3，消泡劑10-30，pH7-7.2；

所述嗜酸乳桿菌的發酵培養基(g/L)：蔗糖20-40，酵母浸膏40-60，無水乙酸鈉5-10，磷酸氫二鉀1-3，檸檬酸氫二銨2-4，硫酸鎂0.5-1.0，硫酸錳0.1-0.3，吐溫-801-3mL，碳酸鈣1-3；

所述釀酒酵母的發酵培養基(g/L)：葡萄糖15-30，酵母浸粉10-20，硫酸銨4-8，pH 6.2。