[發明專利]酮還原酶、核酸、重組表達載體、重組表達菌株及應用

有效

• 申請號: 201711481250.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108220261B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 葛德培;吳其華;洪炯;劉濤;王海濤
• 申請（專利權）人: 安徽聯創生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 合肥市科融知識產權代理事務所(普通合伙) 34126
• 代理人: 陳思聰

1.一種酮還原酶，其特征在于：所述酮還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一種編碼權利要求1所述酮還原酶的核酸。

3.一種包含權利要求2所述核酸的重組表達載體。

4.一種包含權利要求3所述重組表達載體的重組表達菌株。

5.權利要求4所述重組表達菌株的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(a)將權利要求3所述重組表達載體轉化到宿主細胞，涂布在含有50μg/mL氨芐的LB平板上，37℃過夜培養后，從中挑選陽性菌落接種到50mL液體LB培養基中進行培養；培養4h后，吸取10ml種子液轉入1L新鮮的LB液體培養基；

(b)當培養的濃度達到OD₆₀₀＝0.6-1.0時，加入終濃度為0.05～1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行誘導，誘導溫度為16-35℃，誘導培養8-16h，誘導培養后通過離心或濃縮得到更高濃度的濕菌體，經過超聲波破碎或者高壓均質機破碎后離心收集上清液，即為重組表達菌株的粗酶裂解液。

6.根據權利要求5所述重組表達菌株的制備方法，其特征在于：步驟(a)中所述液體LB培養基成分為：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.2；所述宿主細胞為大腸桿菌E.coli BL21；步驟(b)中加入終濃度為0.15mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行誘導，誘導溫度為28℃，誘導培養12h。

7.權利要求1所述酮還原酶在不對稱還原制備(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶中的應用，其特征在于：在pH 6.0～8.0的緩沖液中，在葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶存在下，所述酮還原酶對前體羰基化合物進行不對稱還原反應，形成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶。

8.根據權利要求7所述酮還原酶在不對稱還原制備(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶中的應用，其特征在于：包括以下步驟：

(1)在燒瓶中加入500ml 50mM的磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液pH為6.0-8.0，攪拌；

(2)再加入所述酮還原酶，葡萄糖脫氫酶和葡萄糖，再加入NAD輔酶以及前體羰基化合物，再用磷酸鹽緩沖液定容，在25-35℃溫度下反應，用2mol/L的氫氧化鈉控制pH，反應16h后用TLC點板檢測反應完全；

(3)將反應體系升溫至70℃加熱2h，加入硅藻土過濾除蛋白，用等體積乙酸乙酯萃取水相和洗滌濾餅；

(4)萃取兩次后合并有機相，用無水硫酸鈉干燥后減壓旋蒸得油狀物粗品，即得(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶。

9.根據權利要求8所述酮還原酶在不對稱還原制備(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶中的應用，其中，步驟(2)中所述NAD輔酶為NAD⁺或NADP⁺，所述NAD輔酶的用量為0.01～0.1g/L；所述前體羰基化合物為N-Boc-3-哌啶酮，所述N-Boc-3-哌啶酮在反應液中的濃度為10-200g/L；所述酮還原酶的用量為100～1000U/L；所述葡萄糖的用量為20～200g/L，所述葡萄糖脫氫酶的用量為100～2000U/L，所述葡萄糖的濃度為所述前體羰基化合物的1.2-1.5當量。

10.根據權利要求8-9任意一項所述酮還原酶在不對稱還原制備(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶中的應用，其特征在于：步驟(1)中所述磷酸鹽緩沖液pH為7.0，步驟(2)中在30℃溫度下反應。