[發明專利]引物組、試劑盒以及同時檢測單態性單核苷酸重復位點微衛星不穩定的方法

在審

• 申請號: 201711478674.2
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN107937396A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 李長平;董超;王秀莉;郭琦;盧孟孟;宋廷瑞
• 申請（專利權）人: 北京蓮和醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 趙天月

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及引物組、試劑盒以及同時檢測NR-21、 NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27單態性單核苷酸重復位點微衛星不穩定的方法。

背景技術

微衛星(Microsatellite)DNA是廣泛分布于原核和真核生物基因組中短的串聯重復序列，約占人類基因的10％，核心序列為1～6bp。這類基因多位于基因非編碼區及染色體的近端粒區，在人群中表現為高度多態性主要是由于重復序列長度的數目不同，正常個體體細胞在生長發育過程中其長度(或重復序列的重復次數)保持不變。經統計學計算，微衛星的自發突變率為10⁴～10⁵。微衛星DNA具有較高的遺傳穩定性，呈孟德爾共顯性遺傳。體細胞的 MSI首先在研究結腸癌組織的研究中發現：在大部分患者特別是遺傳性非息肉性結腸癌 (HNPCC)患者的腫瘤細胞中廣泛存在DNA重復序列長度的改變(即MSI)，其重復序列長度越長，突變頻率越高。產生MSI的原因主要是DNA復制過程中滑動或修復時滑動鏈與互補鏈堿基錯配，導致一個或幾個重復單位的插入或缺失，由于重復拷貝數發生大的變化而使某些重要功能的基因發生功能改變，其中涉及到的重要基因是錯配修復基因(如hMHL1， hMSH2，hMSH6等)。這類基因表達產物的功能是糾正因環境因素所致的DNA復制過程出現的錯誤，確保復制過程的“保真性”。當發生MSI時修復能力即大大減弱，甚至失去活性。如果MSI發生于控制生長和增殖的基因(如BAX和TGFB)，將導致腫瘤的發生。細胞DNA 錯配修復系統基因突變，使得在DNA復制過程中出現的錯誤無法得到糾正，導致基因突變率升高，微衛星序列和其他序列突變的累積致使MSI的發生，同時也一步步邁向惡性變的過程，最終形成MSI型結腸癌。錯配修復系統功能喪失是MSI型結腸癌形成過程中的早期分子生物學事件。

MSI分為三類：①高頻微衛星不穩定(High-frequency microsatellite instability，MSI-H)： 2個或2個以上微衛星位點不穩定(或檢測的大板標記中>30％的位點不穩定)。②低頻微衛星不穩定(Low-frequency microsatellite instability，MSI-L)：只有1個微衛星位點不穩定 (10％～30％標記位點不穩定)。③微衛星穩定(Microsatellite stability，MSS)：無不穩定微衛星位點(<10％標記點不穩定)。

1998年，美國國立癌癥研究院協作組推薦2個單核苷酸位點(BAT-25、BAT-26)和3個雙核苷酸位點(D2S123、D5S346、D17S250)作為MSI檢測的標記點，但由于雙核苷酸位點具有多態性，在群體中重復單位的數目表現雜合性，為了提高MSI檢測的準確性，故推薦病理學家從腫瘤組織周圍的正常組織或者抽血提取DNA與腫瘤組織配對進行MSI檢測。 2004年，新的專家共識意見中推薦5個準單態性的單核苷酸位點(BAT-25、BAT-26、NR-21、 NR-24、NR-27)作為MSI檢測的標記點。其原因是研究發現單核苷酸標記位點在大部分個體的等位基因中重復單位的數目是相同且恒定，故單核苷酸標記位點可被看作準單態性。因此，采用單核苷酸標記位點進行MSI檢測，無需對腫瘤組織配對正常組織的DNA進行 MSI檢測，不但可以提高MSI檢測的敏感性，而且降低成本和時間損耗。

自此，尋找新的準單態性的單核苷酸位點成為研究的熱點。2005年有學者不但發現了新的準單態性的單核苷酸位點CAT25，而且研究表明僅采用3個單核苷酸位點(BAT-25、 BAT-26、CAT-25)檢測的敏感性和特異性可以與之前美國國立癌癥研究院協作組推薦的2 個單核苷酸位點和3個雙核苷酸位點的方法等同。2012年又有學者發現了新的單核苷酸位點MT1XT20，初步的研究表明其具有不錯的敏感性和特異性。