[發明專利]一種遠程采樣水稻籽粒碳代謝關鍵酶活性檢測方法

在審

• 申請號: 201711473121.8
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108195646A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 郭龍珠;呂純波;周光濤;郭龍勝;朱偉峰
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/42;G01N33/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

本申請公開了一種遠程采樣水稻籽粒碳代謝關鍵酶活性檢測方法，采用液氮保存、保溫瓶運輸，實驗室籽粒帶殼磨樣、改進方法檢測、數據還原；本申請方法能提高遠距離水稻分子酶活測定研究的準確性和精度；由于采取了籽粒帶殼測定酶活性，適用于碳代謝和氮代謝酶活檢測的采樣，使灌溉機理實驗不再局限于近距離取樣；拓展了遠距離試驗區的研究，應用前景較廣。

技術領域

本申請屬于農業生物技術領域，尤其涉及一種遠程采樣水稻籽粒碳代謝關鍵酶活性檢測方法。

背景技術

水稻籽粒中淀粉含量約占90%，水稻籽粒充實的過程就是淀粉積累的過程。因此，淀粉在籽粒積累的速度和持續時間，決定了籽粒充實的優劣和籽粒的重量。水稻碳代謝是最基礎的代謝,直接關系到水稻的產量與品質。

在淀粉生物合成、優質水稻品種選育和品質遺傳改良研究中，通常要測定水稻碳代謝關鍵酶的活性。近年來的研究表明，無論是高等植物的光合器官還是非光合器官，ADPG焦磷酸化酶(ADPglucose pyrophosphorylase,EC 2 . 7 . 7 . 21, AGPP)和淀粉合成酶( Starch syn-thane , EC 2 . 4 .1. 21, SSS)及淀粉分支酶( tarchbranchingenzyme, EC 2.4.1.18,SBE)是籽粒淀粉合成代謝的幾個關鍵酶，對水稻籽粒中淀粉合成和積累起著重要的調節作用。

常規采用以下方法取樣測定碳代謝酶活性：在抽穗期，各小區選取生長整齊一致且同日抽穗的稻穗掛牌標記，自抽穗第10天起，測試抽穗后每5天的碳代謝酶活性，該取樣時間能夠確定水稻籽粒充實過程的分子酶活性變化規律。每次于上午9:00一9:30取標記穗，迅速裝入凍存管用液氮冷凍處理后，運輸至目的地后保存于-20℃冰柜中。待測定樣品時，每穗上只選取灌漿基本一致的穗中部充實粒用于酶活性測定，以消除開花時間的差異所帶來的誤差，粗酶液的提取取樣品籽粒30粒，去殼去胚，稱重。在預凍的研缽中研磨，提取介質為：10mL緩沖液0.1 Mol / L1mL研磨、3次3mL沖洗(體系為： Hepes-NaOH(pH 7.6)，5mmol / L MgC1₂，5mmol/ L DTT（二硫蘇糖醇），2 % (W / V)PVP（聚乙烯比咯烷酮）)，研磨液在10 000r/min下冷凍離心10 min，取上清液用于酶活性測定。測定時取1mL粗酶液，加1mL 0.2mol/L檸檬酸緩沖液（pH7.0），加0.5mL 0.1mol/L EDTA后振蕩，再加0.5mL0.75%可溶性淀粉，搖勻，在37℃水浴中保溫40min后，加4mL 10%三氯乙酸(TCA)終止反應。5000×g離心8min，取上清液，加0.3mL碘液顯色，10 min后測波長660nm處光密度值，以零時為對照，按△OD660(%)=[OD660(零時-OD660(t時)]/OD660(零時)x100%計算酶活性。

這種方法比較適合近距離的采樣，當試驗采樣地點與酶活測試地點相距較遠時，如果將液氮冷凍過后的籽粒樣品解凍，剝除再剝除籽粒外殼，不僅需要大量時間，而且由于酶在常溫下會失活，溫度的變化也會對酶活性的測定產生很大影響，使得實驗結果的精度大大降低。然而目前部分試驗需要從較遠的試驗現場采樣，再帶回實驗室測試酶活性，有時也存在采樣時沒有足夠的時間剝除籽粒外殼的情況。這時，怎樣才能不考慮籽粒剝殼環節，同時將實驗結果影響盡量減少，是困擾眾多實驗者的一個實用問題。

目前國內尚無相關申請專利，設計一種準確性和精度高、應用前景較廣的遠程采樣水稻籽粒碳代謝關鍵酶活性檢測方法是非常必要的。

發明內容

解決的技術問題：

本申請針對上述技術問題，提供一種在遠距離采樣不具備去殼可能時，帶殼進行遠程采樣水稻籽粒碳代謝關鍵酶活性檢測方法，解決現有測定方法操作復雜、準確性和精度低等技術問題。

技術方案：