[發明專利]一種制備抗癌胚抗原的納米抗體的方法

有效

• 申請號: 201711469625.2
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108103068B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 宋海鵬
• 申請（專利權）人: 深圳市國創納米抗體技術有限公司
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/81;C12N1/19;C07K16/30;C12R1/645
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明提供了一種制備抗癌胚抗原的納米抗體的方法，所述方法包括以下步驟：(1)擴增癌胚抗原納米抗體的編碼基因；(2)將步驟(1)獲得的編碼基因連接于表達載體pKLAC2；(3)將步驟(2)獲得的載體轉導入宿主細胞乳酸克魯維酵母中；(4)誘導步驟(3)獲得的宿主細胞，收獲表達的抗癌胚抗原的納米抗體。本發明還提供了含有抗癌胚抗原納米抗體的表達載體和含有該載體的宿主細胞乳酸克魯維酵母。采用本發明所述的方法，使得表達的納米抗體分泌到細胞外，雜蛋白較少，Western Blot檢測目的條帶單一，從而降低了分離純化的成本，而且大大提高了表達的效率；其中在搖瓶培養的條件下，胞外分泌量為0.8mg/l，通過直接偶聯法測得抗癌胚抗原的納米抗體親和力為5.042×10^?9。

技術領域

本發明涉及一種抗體蛋白的制備方法，更具體地涉及一種使用乳酸克魯維酵母制備納米抗體蛋白的方法。

背景技術

癌胚抗原(CEA，又稱為CEACAM-5或CD66e)是一種分子量約為180kDa的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一員，最初分類為僅在胎兒組織中表達的蛋白質，現在已經在正常成年組織中鑒定出。CEA的過量表達在結腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝細胞瘤、乳腺癌以及甲狀腺癌等癌癥中檢測到。因此，CEA已經被鑒定為腫瘤相關抗原，同時CEA也已被用作腫瘤標記，測量癌癥患者血液中升高的CEA的免疫學測定法已在臨床上用于癌癥的預后和控制。

目前，CEA已經成為靶向治療的潛在腫瘤相關抗原。CEA靶向免疫治療癌癥有2種方式，一種方式是使用抗CEA抗體引發免疫細胞的溶解活性，特別是通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)，以消除表達CEA的腫瘤細胞；另一種方式是通過抗CEA抗體或抗體片段與藥物、毒素、放射性核苷酸、免疫調節劑或細胞因子等效應分子綴合，特異性靶向表達CEA的腫瘤細胞，從而發揮效應分子的治療作用。

1993年比利時科學家研究發現，在羊駝外周血液中存在一種天然缺失輕鏈的抗體，該抗體只包含一個重鏈可變區和兩個常規的CH₂與CH₃區。由于該類抗體為去除恒定區后的可變區序列，分子量約為15kDa，10納米的直徑，因此也被稱為納米抗體。此外，在鯊魚中也觀察到這類單結構域抗體。相對于傳統的四鏈抗體而言，納米抗體在親和力與傳統抗體相當，但在可溶性、穩定性、對聚集的抗性、可重折疊性、表達產率以及DNA操作等諸多方面優于傳統抗體。

考慮到工業應用上的簡便和高效，目前多采用在大腸桿菌中表達納米抗體的方法，但是，這種表達方法的缺點在于抗體不能進行糖基化的修飾，其次是納米抗體中會含有內毒素，這些缺點都限制了納米抗體在制約學和臨床醫學上的應用。而對于將畢赤酵母作為表達宿主菌，雖然也能成功地表達分泌納米抗體，但是由于在納米抗體表達的過程中，需要甲醇作為誘導劑，由此帶來了一定的弊端：一是甲醇加入過量會對酵母本身產生一定的毒性，從而影響納米抗體的產量；二是甲醇本身是不符合食品與藥品安全級別的，且后續需要對甲醇進一步的去除，操作起來比較復雜。釀酒酵母表達系統存在發酵密度不高，分泌表達能力較差以及過度糖基化等。綜合多方面考慮，產物能否分泌到胞外、產物的穩定性、是否會出現特殊的副產物、食品和藥物的安全級別等方面，乳酸克魯維酵母是酵母表達系統中最好的選擇。目前，已有一些藥用蛋白表達成功并得到了應用。

乳酸克魯維酵母是生物技術科學領域非常重要的酵母之一，在食品安全應用行業和工業規模化生產酶方面具有重要意義。乳酸克魯維酵母作為蛋白表達系統已在食品行業得到應用。由于納米抗體在分子量、空間結構等方面的獨特特點，相對于傳統的乳酸克魯維酵母表達存在一定的難度，目前尚未在酵母細胞中表達抗癌胚抗原(Anti-CEA)的納米抗體的報道。但是鑒于乳酸克魯維酵母作為工程菌，最重要的一點是該菌是經美國食品與藥品管理局(FDA)及中國衛生部確定了的能夠達到食品安全級別的可食用酵母，且不需要消除特殊的副產物的優點，如果能夠實現抗癌胚抗原的納米抗體在乳酸克魯維酵母中的表達，則可以為該蛋白在工業化制備方面，以及未來在制藥和診斷制劑領域的應用奠定基礎。

發明內容