[發明專利]基于人源間皮素抗體的嵌合抗原受體、慢病毒表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201711468881.X
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109608549B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 張毅;李峰;張震
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 高姍

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于人源間皮素抗體的嵌合抗原受體、慢病毒表達載體及其應用，所述嵌合抗原受體由人CD8a分子信號肽、人源間皮素單鏈抗體、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜區與胞內區、人41BB分子胞內區、人CD3z分子胞內區依次串聯構成。本發明制備的嵌合抗原受體能夠靶向間皮素，提高CAR?T細胞治療效果。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于人源間皮素抗體的嵌合抗原受體、慢病毒表達載體及其應用。

背景技術

間皮素(mesothelin)在多種腫瘤中高表達，是一種較好的腫瘤治療靶點。利用轉基因技術，將識別間皮素的嵌合抗原受體(CAR) 序列轉導入T細胞中，能夠產生特異識別間皮素、殺傷腫瘤細胞的 CAR-T細胞。CAR-T細胞治療在血液系統腫瘤中展示了良好效果，但在實體腫瘤中的效果卻難以令人滿意。CAR-T細胞在實體瘤治療中出現的短板與以下3個問題有關：1、CAR-T細胞識別區的來源是人源或是其他物種；2、CAR中的連接片段是否能夠高效將胞外識別區信號傳遞給胞內活化區以啟動T細胞殺傷；3、CAR活化后是否會導致T細胞迅速無能乃至耗竭。

發明內容

本發明主要提供了一種基于人源間皮素抗體的嵌合抗原受體、慢病毒表達載體及其應用，所述嵌合抗原受體能夠靶向間皮素，提高 CAR-T細胞治療效果。其技術方案如下：

一種基于人源間皮素抗體的嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體由人CD8a分子信號肽、人源間皮素單鏈抗體、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜區與胞內區、人41BB分子胞內區、人CD3z分子胞內區依次串聯構成。

優選的，所述人CD8a分子信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述人源間皮素單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述人CD8a分子柔性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述人CD28分子跨膜區與胞內區的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述人41BB分子胞內區的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述人 CD3z分子胞內區的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一種核酸序列，所述核酸序列用于編碼上述嵌合抗原受體，所述核酸序列如SEQID NO.8所示。

一種慢病毒表達載體，所述載體載有上述嵌合抗原受體。

優選的，所述嵌合抗原受體為在pCDH-EF1-MSC質粒中表達，形成pCDH-EF1-CAR-meso28BBz制粒。

一種慢病毒，所述慢病毒為將上述慢病毒表達載體與包裝制粒 psPAX2和pMD2.G共轉染靶細胞得到。

上述嵌合抗原受體在制備靶向間皮素的CAR-T細胞中具有醫學上的應用。

采用上述方案，本發明具有以下優點：

(1)CAR主要由3部分構成：胞外識別區、信號轉導區和胞內信號區。其中，胞外識別區決定了CAR-T細胞殺傷的特異性，往往由scFv序列構成，但很多scFv序列是小鼠來源的，會造成較強的免疫排斥反應，導致CAR-T細胞治療無效。而我們選擇了高親和性識別間皮素的人源scFv序列(anti-meso scFv)，既能夠有效避免免疫排斥，又能夠高效識別靶細胞。胞內信號區也是決定CAR-T細胞治療效果的重要結構，我們通過加入CD28和41BB雙信號分子，顯著提高了CAR-T細胞的功能與擴增。信號轉導區的結構選擇也影響 CAR-T細胞功能。我們利用CD8鉸鏈區保證胞外識別區與信號區之間有了很好的結合，保證了CAR-T細胞的功能。此外，我們還添加了CD28與41BB雙刺激分子結構，既保證了T細胞殺傷能力，還能維持T細胞增殖。