[發(fā)明專利]用于EGFR基因突變檢測的試劑盒及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711468609.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108130362A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韋玉軍;李航;劉文干;蘇軍;吳遠
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽安龍基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 王桂名

本發(fā)明公開一種用于EGFR基因突變檢測的試劑盒及應(yīng)用，屬生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的引物、探針和擴增體系的試劑盒檢測靈敏度高，可檢測突變含量低至0.1％的標本；檢測準確率高，采用雙控檢測體系和鎖核酸技術(shù)，保證檢測結(jié)果的可靠性；僅需8個反應(yīng)，包括EGFR質(zhì)控反應(yīng)液、L858R檢測反應(yīng)液、19del檢測反應(yīng)液、G719X檢測反應(yīng)液、L861Q檢測反應(yīng)液、3Ins20檢測反應(yīng)液、T790M檢測反應(yīng)液和S768I檢測反應(yīng)液，即可用于檢測非小細胞肺癌患者的血清或血漿、組織樣本中EGFR基因的29種常見突變型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，尤其涉及的是一種用于EGFR基因突變 檢測的試劑盒及應(yīng)用，包括EGFR基因突變檢測的試劑盒及其引物、探針和擴增 體系。

背景技術(shù)

目前，肺癌己成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發(fā)病例150萬， 嚴重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細胞肺癌約(NSCLC)占80％，且就診 時80％己失去手術(shù)或放射治療最佳機會，致使其長期生存率低，療效令人堪憂。 IIIB/IV期非小細胞肺癌2年生存率僅10％-20％，中位生存時間僅10-12月。因 此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶 向治療為代表的新治療方法，為晚期NSCLC的治療帶來了新的希望。

人類表皮生長因子受體(epidermal growth faCtor receptor，EGFR)是目前治療最重要的分子靶點，其是原癌基因C-erbB-1(Her-1)的表達產(chǎn)物。該基因位于 人類7號染色體短臂7p12～14區(qū)，由28個外顯子組成，該蛋白屬于受體酪氨 酸激酶(TKI)家族，存在于所有正常上皮和部分間葉來源的細胞。EGFR可以激 活酪氨酸激酶，從而調(diào)控下游信號通路最終介導細胞分化、生存、遷移、侵襲、 黏附和細胞損傷修復等一系列過程，在腫瘤惡性生長中發(fā)揮重要作用。因此， EGFR成為腫瘤靶向治療研究的一個重要靶點。

目前，EGFR的靶向治療主要基于小分子酪氨酸激酶抑制(EGFR-TKI)和單 克隆抗體兩種機制。其中，基于EGFR-TKI機制的吉非替尼(Gefitinib，商品名 易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib，商品名特羅凱)，是目前腫瘤患者最有效的靶向藥 物，但這些靶向藥物并非對所有患者有效，EGFR敏感突變是藥物有效的前提。 臨床研究結(jié)果表明，吉非替尼對EGFR外顯子18、19或21發(fā)生突變的患者， 有效率可達80％，而對野生型患者基本無效。目前已發(fā)現(xiàn)至少30種突變 EGFR-TKI藥物反應(yīng)性有關(guān)，主要是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變。此外，研究表明部分EGFR-TKI類藥物初始治療有效的患者在后 期會發(fā)生耐藥反應(yīng)，這與EGFR20號外顯子的突變密切相關(guān)，其中50％的 EGFR-TKI耐藥由外顯子20的T790M點突變所致。

EGFR基因的酪氨酸激酶區(qū)存在多種突變，其中29種為常見突變(見表 1)，主要集中在外顯子18-21上，其中約90％存在于外顯子19和21上，包括外 顯子19上747-750位氨基酸之間的19種常見缺失突變約占突變的45％；外顯 子21上的L858點突變約占突變的40％-45％，這些位點也是中國人EGFR基因 的熱點突變。

大部分腫瘤的突變都是體細胞突變，突變細胞往往與野生型細胞混雜在一 起。因此所提取的DNA常帶有大量野生型DNA，所以對體細胞突變檢測需要 較高的特異性，而目前廣泛使用的直接測序法檢測能力有限，不能完全滿足臨 床需要。特異性探針法如以Scorpions ARMS為代表的英國DxS和中國廈門Adx 的EGFR檢測試劑盒雖然檢測靈敏度高，但其檢測費用較高，不適合國內(nèi)NSCLC 患者的常規(guī)檢測和篩查，因此，臨床迫切需要開發(fā)一種快速準確、操作簡便、 靈敏度高的檢測EGFR基因突變的試劑盒，滿足臨床用藥和檢測診斷的時效性 要求。