[發明專利]中樞記憶性T細胞體及其外培養方法

有效

• 申請號: 201711466562.5
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108165529B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 吳海濤;聶慧蓉;施念;沈政;吳靈
• 申請（專利權）人: 北昊干細胞與再生醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

本發明公開了一種中樞記憶性T淋巴細胞的體外培養方法，該方法包括以下在初始培養基中加入有IL?21，培養環境中氧氣濃度為1±0.1％；在培養第7天時，再擴增培養基中加入有IL?21和雷帕霉素。本發明首次公開了在恰當的培養過程中，應用雷帕霉素、白介素21和低氧環境，三者聯合，可以提高中樞記憶性T細胞比例、抑制其向效應細胞分化、增加其對腫瘤細胞的殺傷作用的體外培養擴增方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體是涉及一種中樞記憶性T淋巴細胞及其體外培養方法。

背景技術

過繼性免疫細胞治療是指將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，以殺傷患者體內的腫瘤細胞。過繼性免疫細胞治療是當前腫瘤免疫治療中新興的、具有顯著療效的一種治療手段。其中，T細胞過繼免疫治療是現在國際上應用的最廣泛效果最顯著的免疫治療手段，其作用原理是利用體外擴增激活的特異性T細胞實施對抗原的殺傷功能。

特異性T細胞主要分為兩種，CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞。在細胞過繼免疫治療中，CD4⁺T細胞除了自身具有殺傷能力外，更可以輔助機體自身的免疫細胞以及共過繼的免疫細胞，具有很強的泛用性，并能與CD8⁺T細胞相互補充。CD4⁺T淋巴細胞可以分為三個亞群，初始T淋巴細胞、效應性T淋巴細胞以及記憶性T淋巴細胞。記憶性T細胞根據是否表達歸巢受體CCR7和CD62L分為中樞記憶性T細胞(central memory T cell，TCM)和效應記憶性T細胞(effector memory T cell，TEM)。TCM細胞表達CCR7和CD62L，主要分布于淋巴結和扁桃體等，TEM主要分布在外周組織中。TEM細胞在體內存活壽命短，雖然有一定的清除效果，但無法達到長期治療的效果，而TCM細胞則可以在體內維持自我更新，產生持久的殺傷效果，在免疫治療中得到越來越多的重視。

TCM細胞在現在國際頂尖的免疫細胞治療技術中常常作為基因工程的種子細胞進行修飾加工，增強其殺傷腫瘤細胞的能力。比如使用嵌合抗原受體技術(CAR-T)或T細胞受體(TCR-T)技術修飾TCM細胞，便可以獲得殺傷性和持久性都很高的新型免疫細胞，進而應用于惡性腫瘤的治療。

TCM在機體內的比例和數量較少，且隨著體外擴增的進行，TCM極易變成終末分化的效應細胞。因此如何在體外獲得高純度、高活性和較高擴增能力的TCM細胞是細胞免疫治療的一個熱點，也是免疫治療臨床應用所急需解決的一個難題。

發明內容

為解決中樞記憶性T細胞體外擴增純度低和較易轉化為效應細胞的問題，本發明目的之一是提供了一種中樞記憶性T細胞的體外培養方法，該方法提高了中樞記憶性T細胞比例和功能性。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一種中樞記憶性T淋巴細胞的體外培養方法，包括以下步驟：

在細胞培養板中，包被CD3抗體；

加入初始培養基和分選出來的T細胞進行培養，培養環境中氧氣濃度為1±0.1％；初始培養基中加入有IL-21；

繼續培養，每隔兩天補充初始培養基；

第6天時，吸取細胞到離心管中，離心，去上清，用初始培養基重懸，然后轉移到細胞培養板中繼續培養；

第7天時，取培養瓶，包被CD3抗體；將T細胞轉移到離心管中，離心，去上清，用再擴增培養基重懸，然后轉移到T25培養瓶中繼續培養；所述再擴增培養基中加入有IL-21和雷帕霉素；

繼續培養，每隔兩天補充再擴增培養基，培養到第14收獲中樞記憶性T淋巴細胞細胞。

在其中一個實施例中，所述基礎培養基為AIM V培養基。

在其中一個實施例中，再擴增培養基中所述雷帕霉素的濃度為5-30ng/ml。