[發明專利]應用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀優化方法

在審

• 申請號: 201711463595.4
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108181461A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 李旦
• 申請（專利權）人: 上海嘉因生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/539
• 分類號: G01N33/539;G01N33/58
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及應用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀優化方法，其特征在于，對組織樣本依次進行破碎裂解、制備Fe₂O₃?APTS納米磁珠、結合抗體、免疫共沉淀、洗脫處理，與現有技術相比，本發明能夠在高通量水平上精準定位組蛋白的結合位點，提高臨床樣本的檢測效果。

技術領域

本發明涉及生物學領域，具體涉及應用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀優化方法。

背景技術

免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其基本原理是：細胞裂解液中緩沖溶液后在加入抗體，與抗原形成特異免疫復合物，經過洗脫，收集免疫復合物，然后進行SDS-PAGE及Westernblottin重量份分析。緩沖溶液具有鹽平衡作用，可以破壞生物蛋白的結構及生物特性，同時具有調整pH的作用，對組蛋白與抗體的結合影響較大，使用合適配比成分的緩沖溶液能夠實現組蛋白修飾染色體免疫共沉淀結果的優化。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了應用于組織樣本中組蛋白修飾染色體免疫共沉淀優化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)破碎裂解

用研缽在-10℃冷凍條件下將組織樣本研成粉末，用4℃的PBS溶液洗組織樣本2-3次；對每1g組織樣本，加入0.5ml裂解液，裂解20-30分鐘，將組織樣本裂解液收集到EP管中，加入1ml組織勻漿緩沖液，使用組織勻漿器勻漿30s；將組織懸液置于15℃下，以1000rpm轉速離心10分鐘；放置3-4分鐘，直至裂解液變清，避開上層漂浮的脂質層，取上清液4℃，以3000rpm轉速離心45分鐘，離心去上清；在每1g組織樣本加入10mM甲醛150ul在搖床上搖晃交聯3-5分鐘，加200ul終止緩沖液，在搖床上搖晃5-10分鐘終止交聯；

以重量百分比計，裂解液包括0.05-0.2％的氯化銨、0.08-0.1％的氯化鈉、0.03-1％的EDTA、0.002-0.01％的deoxicholate、0.002-0.01％的Leupeptin、0.2-1％Tritonx-100和0.02-0.2％蛋白酶K；余下部分為去離子水；

以重量百分比計，織勻漿緩沖液包括0.01-0.12％的Tris、0.01-0.1％的氯化鈉、0.05-0.5％的NP40、0.002-0.2％的Aprotinin、0.002-0.2％的Leupeptin，余下部分為去離子水；

以重量百分比計，終止緩沖液包括0.05-0.20％的氯化鈉、0.002-0.02％的碳酸氫銨、0.2-1％Tritonx-100和0.02-0.2％蛋白酶K；余下部分為去離子水；

(2)制備Fe₂O₃@SiO₂-APTS納米磁珠

1)溶劑熱法制備三氧化二鐵納米球，直徑為50-100nm；

2)采用法，在三氧化二鐵納米球外包覆二氧化硅，得到Fe₂O₃@SiO₂納米球，具體步驟為：稱取5重量份步驟1)制備得到的三氧化二鐵納米球，向其中依次加入25重量份去離子水、45重量份無水乙醇和10重量份質量分數為5-15％的氨水，超聲混合均勻后向混合液中加入10重量份正硅酸乙酯，25℃下機械攪拌1小時；反應完畢后，將所得溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗2-3次，將所得產物在50℃-75℃烘箱中干燥待用；