[發明專利]玉米莖腐病抗病分子育種方法及其應用

有效

• 申請號: 201711458417.2
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108004236B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 盧東林;鄒繼軍;阮祥經;談存梅;李曉鵬;馬傳禹;徐明良
• 申請（專利權）人: 袁隆平農業高科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發明涉及分子生物學，具體公開了一種玉米莖腐病抗病分子育種方法及其應用。本發明提供的與玉米莖腐病抗性相關的KASP分子標記可用于莖腐病抗病分子育種和玉米種質資源分析，同時具有成本相對較低和應用靈活性高的特點，可實現高通量檢測。所述分子標記為JFB?3，JFB?4，JFB?5，JFB?6，JFB?7，JFB?8或JFB?9，可由SEQ ID NO.8～28所示的引物分組擴增得到。

技術領域

本發明涉及分子生物學，具體地說，涉及與玉米莖腐病抗性相關的KASP分子標記。

背景技術

玉米莖腐病，也叫莖基腐病，是世界玉米產區普遍發生的一種重要的真菌性土傳病害。近年來莖腐病在我國部分地區發病較為嚴重，根據廣西、浙江、湖北、陜西、河北、山東、遼寧等18個省區調查，發病率一般在10％-20％之間，嚴重年份可達50％-60％，減產約20％，重者甚至絕收。發病時期一般從玉米灌漿期開始，乳熟后期至蠟熟期為發病高峰期。發病時一般從根部開出現腐爛，然后病情往上蔓延出現明顯病葉青枯至全株枯萎，節間變淡褐色，果穗苞葉青干，穗柄柔韌，果穗下垂，不易掰離，穗軸柔軟，子粒干癟，脫粒困難。玉米莖腐病在乳熟后期，常突然成片萎蔫死亡，因枯死植株呈青綠色，故也稱青枯病。從最初出現病葉到全株出現發病癥狀一般在一周左右，歷時時間短的僅1-3天，長的可達15天以上。

目前玉米莖腐病的抗病鑒定主要有田間自然發病鑒定和人工接種鑒定。田間自然發病鑒定主要是在莖腐病高發病區進行田間自然鑒定。人工接種鑒定利用莖腐病病原菌侵染玉米植株，將病原體均勻的接種于根部附近，在玉米乳熟末期、成熟期調查病株率與病級。

玉米莖腐病田間表型的鑒定主要是以發病率和病級兩種方法，發病率是發病株占總株數的百分比，病級則是指植株個體的受害程度。如分別以1、3、5、7、9級分別代表抗性級別極弱、弱、中、強、極強5個抗性評價的標準，則1級的表型：全株枯死且倒伏，莖基部維管束破裂，籽粒干癟；2級的表型：株葉片出現典型青枯癥狀，莖基部明顯變軟但不倒狀，果穗下垂，籽粒不飽滿；3級的表型：全株葉片出現典型青枯癥狀，莖基部變色且稍有水浸狀，果穗基本正常；4級的表型：全株葉片出現青枯癥狀，莖基生長正常，果穗生長正常；5級的表型：全株生長正常，中下部葉片出現青枯/青黃枯癥狀，莖基生長正常，果穗生長正常。

實踐證明，種植抗病品種是防治此病經濟有效的根本措施，而且我國抗源豐富，為選育工作和利用抗病品種提供了保證。同一玉米自交系對莖腐病的抗性，只有不同地區和不同自然條件下都能保持一定的抗性水平，其抗病性才能穩定可靠，用其為親本所配制的雜交種在生產上才能有較好的抗病性能。因此在常規育種中往往需要多年多點的鑒定才能確定育種材料對莖腐病的抗性級別，這大大增加了品種選育的時間和成本，而通過分子標記的手段直接篩選出抗莖腐病的育種材料可以在很大程度上提高育種效率。分子標記輔助選擇利用與抗病QTL緊密連鎖的分子標記對群體中含有抗病QTL的單株進行追蹤，用標記的基因型來確定單株的抗病性。

SNP標記是在基因組中分布最為廣泛的分子標記，其二等位基因的性質使SNP標記的檢測容易實現高通量和自動化，目前在玉米研究領域，SNP標記也已經開始得到廣泛應用，以SNP標記為基礎的抗病輔助育種是玉米分子育種研究和應用的重要領域。KASP是競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的縮寫，可在廣泛的基因組DNA樣品中(甚至是一些復雜基因組的DNA樣品)，對SNPs和特定位點上的InDels進行精準的雙等位基因判斷。實驗流程主要包括：

1、準備：1)兩條末端堿基不同的等位基因正向引物與一條反向引物構成的PrimerMix，兩條正向引物5’端分別連有不同序列的檢測引物序列；2)帶有不同熒光的兩條檢測引物Master Mix；3)DNA模板；

2、PCR反應：1)變性模板與Primer Mix中相匹配的引物結合并退火，延伸后序列被加上了檢測引物的序列；2)等位基因特異性的末端序列的互補鏈合成；3)信號產生-特異序列對應的檢測引物隨PCR反應進行指數性增長，相應信號被檢測。