[發明專利]金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法

在審

• 申請號: 201711457774.7
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN107904287A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 聶丹丹;王寧寧;王準;曲輝;彭勃;孫晶瑩;王瑋琳;劉金華;羅雁非
• 申請（專利權）人: 吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/14;C12Q1/04
• 代理公司: 長春市東師專利事務所22202
• 代理人: 張鐵生

1.金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法，包括以下步驟：

1）稱取25g樣品至盛有225mL無菌培養液的均質袋中，用拍擊式均質器拍打成勻液；增菌培養，金黃色葡萄球菌增菌培養按照GB/T 23743方法進行，蠟樣芽胞桿菌增菌培養按照GB/T 26427方法進行；所述的樣品為飼料或食品；

2）提取待測樣品、陽性對照、陰性對照的DNA；

3）以提取的DNA為模板，加入金黃色葡萄球菌檢測用nuc特異性引物和探針、蠟樣芽孢桿菌的16s保守引物和探針以及酶反應液進行雙重微滴數字PCR反應；

4）反應結束后，進行檢測與分析；

所述的金黃色葡萄球菌檢測用nuc特異性引物和探針、蠟樣芽孢桿菌的16s保守引物和探針為：

nuc基因上游引物： GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG；

nuc基因下游引物： TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT；

nuc探針：5’-（FAM）-CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC-（BHQ1）-3’；

16s保守基因上游引物：CCTTATGACCTGGGCTACAC；

16s保守基因下游引物：AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC；

16s探針：5’-（HEX）-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-（ECLIPSE）-3’。

2. 根據權利要求1所述的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法，其特征在于：步驟3）中所述的雙重微滴數字PCR反應體系為：

2×dd PCR預混液10μL

10 μmol/L nuc基因上游引物1.6μL

10 μmol/L nuc基因下游引物1.6μL

10 μmol/L rfbE基因探針 0.8μL

10 μmol/L 16s保守基因上游引物0.4μL

10 μmol/L 16s保守基因下游引物0.4μL

10 μmol/L16s保守基因探針 0.2μL

1～100 ng/μL模板DNA（金黃色葡萄球菌）4μL

1～100 ng/μL模板DNA（蠟樣芽孢桿菌）1μL；

所述的雙重微滴數字PCR反應條件為：95℃/5min，1個循環；95℃/15s，60℃/1min，40個循環；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反應產物。

3.根據權利要求2所述的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法，其特征在于：步驟4）中所述的反應與分析，是雙重微滴數字PCR反應結束后，檢測所有微滴的熒光信號值并設定閾值，根據熒光信號的閾值確定微滴是否包裹模板DNA，高于閾值的微滴包裹模板DNA，為陽性微滴；低于閾值的微滴不包裹模板DNA為陰性微滴，再根據陽性微滴數計算模板DNA的拷貝數，根據陽性拷貝數值判定結果。

4.根據權利要求3所述的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法，其特征在于：所述的判定結果的方法為：

1）待測樣品金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌基因僅有一種得到擴增，擴增終點熒光信號大于或等于閾值，可判定該樣品結果為陽性，報告檢出金黃色葡萄球菌或蠟樣芽胞桿菌基因；

2）待測樣品金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌基因得到擴增，擴增終點熒光信號大于或等于閾值，可判定該樣品結果為陽性，報告檢出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌基因；

3）待測樣品金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌基因均未得到擴增，擴增終點熒光信號小于閾值，可判定樣品結果為陰性，可報告未檢出金黃色葡萄球菌或蠟樣芽胞桿菌基因。

5.根據權利要求1、2、3或4所述的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法，還設有空白對照、陰性對照和陽性對照，判定標準為：

1）陽性對照：以金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌陽性成分DNA為模板，按照所述的雙重微滴數字PCR反應體系和反應條件，進行雙重微滴數字PCR反應，檢測出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌陽性基因有明顯擴增，擴增終點熒光信號大于或等于閾值；

2）陰性對照：以非目標源性成分DNA為模板，按照所述的雙重微滴數字PCR反應體系和反應條件，進行雙重微滴數字PCR反應，檢測出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌基因均無擴增，擴增終點熒光信號小于閾值；

3）空白對照：以雙蒸水為模板，按照所述的雙重微滴數字PCR反應體系和反應條件，進行雙重微滴數字PCR反應，檢測出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌基因均無擴增，擴增終點熒光信號小于閾值。