[發明專利]一種磷酸化蛋白質富集修飾的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201711448315.2
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108181475B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 葛峰;熊倩;楊明坤;張珈;洪斌;李俊峰;付帥;張書晨
• 申請（專利權）人: 湖北普羅金科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12P21/06
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

本發明屬于蛋白質修飾富集分析領域，具體涉及一種磷酸化蛋白質富集修飾的方法和試劑盒。本發明利用磁性納米材料Fe₃O₄/APTES與經水解成的磷酸化多肽螯合作用，以及Fe₃O₄/APTES中3?氨丙基三乙基硅烷的正電荷與磷酸化多肽的負電荷的靜電作用實現初次富集，并外加磁場分離溶液，再通過納米TiO₂對分離后的溶液進行二次富集；本發明還結合上述方法發明了相應的試劑盒。本發明相比于單一采用磁性納米材料或普通TiO₂進行富集，有效提高了磷酸化蛋白質的選擇性富集效果，提升了質譜檢測精度。

技術領域

本發明屬于蛋白質修飾富集領域，特別是一種磷酸化蛋白質富集修飾的方法和試劑盒。

背景技術

蛋白質磷酸化是生物體中最常見、最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式，它可以通過激發、調節諸多信號通路進而參與調控生物體的生長、發育、逆境應激、疾病發生等多種生命過程，所以磷酸化一直是生物學研究的重點與熱點。

由于翻譯后修飾的蛋白質在生物樣本中含量低、動態范圍廣，因此在進行液相色譜、質譜分析前需要對修飾的蛋白質進行富集以提高其豐度。經豐度提升后，可對經富集的磷酸化蛋白修飾進行高通量鑒定，一次可鑒定磷酸化蛋白的成百上千個修飾位點。研究對象包括動物、植物、微生物的組織、細胞及血清、尿液、腦脊液等體液樣本。

現有技術中，如授權公告號CN103940894B提供的一種同時富集磷酸化肽段和糖基化肽段并質譜分析的方法，只通過使用磁性材料Fe₃O₄@NH₂和外加磁場進行單次富集，富集后溶液中還殘留有少量磷酸化肽段，對檢測精度有一定影響。

發明內容

針對以上現有技術的不足，本發明提供了一種磷酸化蛋白質富集修飾的方法和試劑盒，具體通過以下技術實現。

一種磷酸化蛋白質富集修飾的方法，包括以下步驟：

S1、通過蛋白水解酶水解磷酸化蛋白質，得到溶于緩沖液中的磷酸化多肽溶液；

S2、在磷酸化多肽溶液中加入磁性納米材料，初次富集磷酸化蛋白質，得混合溶液；

S3、在步驟S2所得混合溶液中外加磁場，使磁性納米材料與溶液分離，得初次上層清液和初次下層固體；

S4、收集初次下層固體，用Tris緩沖液清洗初次下層固體且外加磁場，分離得到二次上層清液和二次下層固體收集備用；

S5、將初次上層清液和二次上層清液混勻，加入納米TiO₂進行二次富集，分離得三次下層固體和三次上層清液；

S6、分別對二次下層固體和三次下層固體分別進行質譜分析。

優選地，所述步驟S1的磷酸化多肽溶液的濃度為10ng/μL～50ng/μL，溶于25mmol/L的Tris緩沖液中。

優選地，所述步驟S2的磁性納米材料為通過3-氨丙基三乙基硅烷修飾的Fe₃O₄/APTES納米復合顆粒，所述Fe₃O₄/APTES納米復合顆粒是以FeCl₃和FeSO₄為原料制備的磁性溶液與3-氨丙基三乙基硅烷攪拌制得；所述磁性溶液為50mL，固體含量8mg/mL，所述3-氨丙基三乙基硅烷為分析純，用量為0.2～0.4mL。

優選地，所述步驟S5的納米TiO₂是以鈦酸四丁酯為原料，采用水解法制備得到。

優選地，步驟S2中磁性納米材料富集的溫度為30～40℃，富集時間為6～8min；步驟S5的二次富集溫度為32～42℃，富集時間為2～2.5min。