[發明專利]一種外周血游離腫瘤DNA的富集方法、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201711446648.1
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108251502B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 宋炎;劉磊;葉明芝;王晶晶;劉繼龍;譚美華;茅矛
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司;廣州華大基因醫學檢驗所有限公司;天津華大醫學檢驗所有限公司;華大生物科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;彭家恩

本申請公開了一種外周血游離腫瘤DNA的富集方法、試劑盒及其應用。本申請的富集方法，包括采用PAP探針對cfDNA文庫進行腫瘤DNA片段捕獲，并以PAP探針為引物，以捕獲的腫瘤DNA片段為模板，進行擴增；PAP探針從5’端到3’端由通用引物序列和特異識別序列組成，特異識別序列3’端包括至少30bp的與腫瘤DNA片段雜交互補的序列，PAP探針3’末端為雙脫氧核苷酸。本申請的富集方法，通過PAP探針對靶標腫瘤DNA片段進行捕獲，并利用PAP探針進行延伸；特異性好，捕獲效率高；保證了富集產物的純度，為后續的測序提供了保障。本申請的富集方法，為cfDNA的臨床檢測提供了一種新的游離腫瘤DNA富集方案。

技術領域

本申請涉及腫瘤檢測領域，特別是涉及一種外周血游離腫瘤DNA的富集方法、試劑盒及其應用。

背景技術

惡性腫瘤的發生是一個多基因多事件積累的結果。在腫瘤克隆性演化的過程中，常積累一系列的基因突變，可能涉及不同染色體上多種基因的變化，如癌基因、抑癌基因、細胞凋亡基因、細胞周期調節基因及維持細胞基因組穩定性的基因等。通過高通量測序技術可研究上述基因及其表達mRNA的突變和表達水平的變化，從而揭示腫瘤發生和演化中信號和代謝通路的變化。

腫瘤機制的認識和科學技術的發展進一步促進腫瘤治療理念的轉變，個體化的靶向藥物治療模式在臨床腫瘤治療中占據越來越重要的地位。目前，精準醫療更多的集中在腫瘤的早期診斷及治療領域，基于腫瘤基因檢測的個體化治療成為癌癥治療的重要發展趨勢之一。

目前，針對高發病率的肺癌、胃癌、食道癌、結直腸癌、乳腺癌等癌癥，全世界已經開發出多款相應的抗腫瘤藥物用于臨床治療。然而，臨床用藥數據統計結果表明，即使是使用了相應抗腫瘤藥物的癌癥患者，其預后效果卻不盡如人意；這引起了臨床醫生、學者以科學家們進行了大量的研究和探索發現，目前已經上市的抗腫瘤藥物療效具有個體差異性，特別是在癌癥患者的基因組研究方面，發現患者對藥物是否敏感與其癌細胞的基因組突變直接相關。癌癥患者一旦在部分藥物靶向基因區段發生突變，可能會導致長期服用昂貴的抗腫瘤藥物而病情卻無法緩解的情況。也有研究結果表明，一些在藥靶基因區段發生突變的癌癥患者，對于相應藥物的敏感性增強，而且有更好的預后。這提示，如果對癌癥患者的藥物靶向基因在其用藥前期進行檢測，獲取其基因突變的具體情況，就可以大致預測患者使用相應抗腫瘤藥物的療效。

然而，對于單個藥物靶點的檢測，有時候并不能很好的預測藥物的療效，高通量測序技術的發展使得檢測所有靶向藥物的所有靶點基因成為可能，其檢測結果可指導制定最佳腫瘤治療方案。近期Science上發表了一篇利用基因組測序方法闡明Everolimus（依維莫司）治療膀胱癌作用機制的研究，進一步證明了高通量測序在腫瘤治療中實行個性化的重要性。華盛頓大學基因組研究所對一位患有白血病的患者進行全基因組和轉錄組測序，最終找到了導致其癌癥細胞快速繁衍的“元兇”，一個名為FLT3的基因并恰好找到一種腎癌藥物能夠起效。近年來基于高通量的腫瘤個體化治療已成為科學發現和臨床轉化的熱點。高通量測序技術的發展使得癌癥基因組測序成為可能。通過對患病組織多基因、多位點大規模并行測序，不僅可以一次性篩選各類靶藥位點，提供精準治療方案，更能明確癌癥病因，實現個體化醫療。

近年來的一些研究顯示，腫瘤病人血漿或血清中DNA的遺傳變異與正常人存在較顯著差異，有望成為一種有效的腫瘤治療和監測手段。Dennis Lo近期在Clinchem上發表相關研究，在該研究中對4名肝癌患者和1名乳腺癌和卵巢癌并發患者的外周血漿DNA進行全基因組測序，進一步證明了利用癌癥患者外周血漿DNA結合新一代高通量測序技術在癌癥個體化治療上的可行性。Rebecca J. Leary等在7名晚期結腸癌和3名乳腺癌患者中也進一步證實在血漿中檢測來自腫瘤細胞的拷貝數變異和結構性變異的可行性，以及臨床應用的前景。