[發明專利]一種靶向線粒體的ND4融合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711445919.1
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN109970861B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 李斌
• 申請（專利權）人: 武漢紐福斯生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;A61K38/44;A61P27/02;A61P25/02
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

本發明公開了一種靶向線粒體的ND4融合蛋白，從N端至C端分別包含CAG啟動子、線粒體靶向序列、ND4和UTR，其中所述線粒體靶向序列為OPA1基因的線粒體靶向序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發明公開了編碼所述ND4融合蛋白的核苷酸序列、包含所述核酸的表達載體、表達所述的ND4融合蛋白的細胞株、包含所述的ND4融合蛋白的制劑以及所述融合蛋白的制備方法。還公開了ND4融合蛋白和含ND4融合蛋白的制劑在治療Leber遺傳性視神經病變中的應用。OPA1線粒體靶向序列定向引導ND4蛋白進入線粒體，能較好地治療Leber遺傳性視神經病變。

技術領域

本發明涉及生物制劑領域，尤其涉及一種靶向線粒體的ND4融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

Leber遺傳性視神經病變(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)是一種退行性視力障礙，通常表現為中央視力的雙側喪失。平均發病年齡在20歲中期，通常在數周至數月內沒有疼痛，直到雙眼視力惡化到0.1以下，嚴重影響患者的生活質量。LHON是由于線粒體基因突變引起的，與NADH泛醌氧化還原酶、即線粒體呼吸鏈的復合體I亞基的三個線粒體基因之一的突變有關。研究表明，影響ND1基因的G3460A突變、影響ND6基因的T14484C突變和影響ND4基因的G11778A突變被認為是LHON的主要原因，并且每種突變都具有永久性視力喪失的顯著風險。所有這些都與視網膜神經節細胞的局灶性退化有關。

兩個主要的LHON突變G3460A和T14484C導致患者血小板中分離的線粒體NADH脫氫酶活性降低80％。然而，從G11778A細胞中分離出的線粒體顯示復合物I和呼吸鏈中大多數其他成分的活性接近正常。對中國LHON患者而言，G11778A位點突變患者占90％。在11778位點的突變，使ND4蛋白的精氨酸轉變成組氨酸，導致功能障礙、視神經損傷和Leber遺傳性視神經病變，其發病率高、預后差。

LHON治療的主要問題產生于將DNA輸送到細胞器的障礙。現有技術CN 102634527B公開了一種重組人NADH脫氫酶亞單位4基因及其表達載體構建方法，其大小為2889bp，由COX10的編碼28個氨基酸的肽鏈，引導ND4蛋白進入到線粒體中。CN 104450747 A公開了一種用于治療Leber遺傳性視神經病變的重組腺相關病毒-NADH脫氫酶亞單位4(ND4)基因全長以及藥劑。該基因全長為3824bp，其由CAG啟動子序列、帶Cox10的線粒體定位序列的ND4的編碼序列和長度為625bp的UTR組成。將CN 102634527 B的藥劑，或CN 104450747 A的含有CAG-Cox10-ND4的藥劑注入眼玻璃體腔中，用于治療Leber遺傳性視神經病變，該等藥劑能夠在玻璃體腔內保持活力，并轉染到視神經細胞，該蛋白N前端的信號肽定向引導該蛋白進入線粒體，成熟的ND4蛋白發揮作用。但是，該技術還存在靶向性不高，治療效果不佳的缺點，還有待改進。目前還沒有利用OPA1攜帶融合蛋白來定位線粒體治療疾病的報道，而且OPA1比CoX10序列更長靶向性效果更好，OPA1參與細胞內膜的融合，可以準確的將ND4蛋白定位到線粒體內膜上，本研究是首創的采用OPA1-ND4融合蛋白治療Leber遺傳性視神經病變。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術中ND4融合蛋白靶向性不高、治療效果不佳的技術問題，提供一種靶向性ND4蛋白及其制備方法和應用。

為解決上述問題，本發明的技術方案之一，是提供一種靶向線粒體的ND4融合蛋白，從N端至C端分別包含CAG啟動子、線粒體靶向序列、ND4和UTR，其特征在于，所述線粒體靶向序列為OPA1基因的線粒體靶向序列，所述OPA1基因的線粒體靶向序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

優選地，所述OPA1基因的線粒體靶向序列由序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸編碼。

更優選地，所述ND4融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。