[發明專利]一種利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白的方法

有效

• 申請號: 201711444706.7
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108048479B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 秦麗娜;董志揚;江賢章;黃建忠
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/67;C12R1/885
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白的方法。本發明所提供的利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白的方法，包括如下步驟：將含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒克隆到里氏木霉基因組中cel3c基因的5’UTR區域。本發明實驗證明在cbh1基因缺失株中，將cbh1基因的表達骨架整合入位點M29，并與野生菌株比較cbh1基因的表達水平，發現將重組基因插入該位點，可以獲得優于cbh1位點的表達水平。本發明進一步豐富完善了利用里氏木霉作為宿主高效表達重組蛋白的技術方案。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白的方法。

背景技術

絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是工業上主要的纖維素酶半纖維素酶生產菌株，是美國FDA認證的食品安全級菌株。里氏木霉具有強大的蛋白分泌能力，某些突變株的外分泌蛋白量可達100g/L，并具有與高等哺乳動物相似的糖基化系統，因此里氏木霉是一種非常理想的重組蛋白表達宿主，得到國際著名酶制劑公司(如Genencor、Novozymes等)的高度重視，并成功應用于多種藥物、化學試劑以及酶制劑的表達和生產。近年來，隨著里氏木霉基因組學的快速發展及其遺傳操作系統的不斷完善，利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白也越來越受到重視。

值得指出的是，里氏木霉中外源DNA片段多以非同源末端連接的途徑NHEJ(nonhomologous end-joining)整合入基因組，呈隨機插入的形式。重組蛋白的基因表達框在基因組中的不同的插入位點會直接影響到其表達水平。例如，若重組基因插入到沉默子的調控區可能直接導致其不能轉錄而表達失敗，如果外源基因插入到增強子的調控區域也可能使其表達量大幅度提高。里氏木霉中纖維二糖水解酶基因(cbh1)的位點通常被認為是基因高效表達的位點。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白的方法。

本發明所提供的利用里氏木霉作為宿主表達重組蛋白的方法，可包括如下步驟：將含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒克隆到里氏木霉基因組中cel3c基因(Locustag:TRIREDRAFT_82227)的5’UTR區域。

其中，所述“將含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒克隆到里氏木霉基因組中cel3c基因的5’UTR區域”可為如下任一：

(a)用所述含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒取代所述里氏木霉基因組中cel3c基因的5’UTR區域中任意片段；

(b)將所述含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒插入到所述里氏木霉基因組中cel3c基因的5’UTR區域中的任意位置。

進一步地，所述里氏木霉基因組中cel3c基因的5’UTR區域的核苷酸序列為SEQ IDNo.1。

在本發明的實施例中，所述“將含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒克隆到里氏木霉基因組中cel3c基因的5’UTR區域”具體為：將所述含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒取代所述里氏木霉基因組中SEQ ID No.1的第141到第164位。

如同本領域的常規理解，在上述方法中，所述含有待表達的目的蛋白的編碼基因的表達盒自5’端到3’端依次包含啟動子、由所述啟動子啟動表達的所述待表達的目的蛋白的編碼基因，以及終止子。當然，根據需要還可以包含其他類型的調控序列。