[發明專利]一種基于熒光微球標記的微囊藻毒素免疫定量試紙條

在審

• 申請號: 201711444279.2
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108152500A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 孫秀蘭;劉瑩;紀劍;皮付偉;張銀志;陸勇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基于熒光微球標記的微囊藻毒素免疫定量試紙條，屬于免疫分析快速檢測技術領域。本發明通過標記熒光微球制備熒光探針，包括熒光微球?微囊藻毒素人工抗原和熒光微球?羊抗兔二抗。將羊抗鼠二抗和兔IgG抗體分別噴涂于硝酸纖維素膜作為檢測線和質控線制得免疫層析試紙條；利用競爭免疫法，通過讀取熒光免疫分析儀上檢測線的熒光值，對樣品中微囊藻毒素進行定量分析。該方法不但克服了試紙條技術中膠體金不易保存的缺點，而且制備熒光探針的方法簡單高效。

技術領域

本發明涉及一種基于熒光微球標記的微囊藻毒素免疫定量試紙條，屬于免疫分析快速檢測技術領域。

背景技術

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一類具有生物活性的七肽單環化合物，是具有強烈促癌作用的肝毒素。其主要由淡水藻類銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)產生，具有相當的穩定性。目前為止，已發現80種不同的微囊藻毒素亞型，其中以可變氨基酸為亮氨酸(L)和精氨酸(R)的微囊藻毒素-LR(Microcysitn-LR,MC-LR)的毒性最強，目前已知毒性僅次于二惡英。飲用水中低劑量的該毒素就可以引起人的肝臟損傷，促進肝癌的發生，給人類的健康帶來巨大的威脅與隱患。

目前，檢測水體中微囊藻毒素的方法主要分為三種：生物測定法、化學分析法、免疫分析法。生物測定法是最早采用的一類毒性分析法，利用動物體內實驗、細胞毒性實驗等來觀測藻毒素毒性，其具有操作簡單，可獲取器官的病理資料等優點，但存在工作量大、毒素消耗量大、專一性和靈敏度差、無法進行定量分析等缺點。化學分析法是利用光電技術以及樣品的理化性質進行分離純化和定性定量分析的一種方法。其中高效液相色譜法(HPLC)因其測量準確靈敏、重現性好、能同時分析出不同的藻毒素異構體而應用廣泛，但存在需要高純度的標準品、待測樣品需要預處理、儀器價格昂貴、需要專業操作等不足之處。

免疫分析法利用毒素誘發免疫反應產生抗體，抗體和抗原進行特異性結合來進行毒素檢測。由于其簡便快捷、方便攜帶以及成本低的特性，具有良好的發展趨勢。市場上已有膠體金免疫層析試紙條，是以硝酸纖維素膜為固相載體，將膠體金與待測物的抗體/抗原相結合作為標記物，通過毛細管作用使待測樣品以及標記物在層析試紙條上移動，經過硝酸纖維素膜時，與提前噴涂的抗原/抗體以及二抗發生免疫反應，最后通過檢測線和質控線處顏色的深淺來判斷測試結果。該檢測技術操作方便、樣品無需預處理、特異性好，但其應用的是單份試劑，難以進行質量控制，且靈敏度不高，動態檢測范圍窄，只能用于定性分析。

我國微囊藻毒素污染范圍廣，常用檢測方法無法滿足要求，亟需研究出更加靈敏、方便的可用于現場快速、高通量檢測的方法。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明提供了一種基于熒光微球標記的快速檢測微囊藻毒素的免疫定量試紙條。本發明采用了熒光微球替代膠體金，制備熒光微球標記的微囊藻毒素人工抗原，將其作為熒光探針用于免疫層析檢測微囊藻毒素，結果表明該方法可以快速定量檢測微囊藻毒素。

本發明提供的基于熒光微球標記的微囊藻毒素免疫定量試紙條，是在硝酸纖維素膜(NC膜)上分別噴涂羊抗鼠二抗和兔IgG抗體，分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)，兩線之間相距0.4-0.8cm，干燥后，貼上吸水紙和樣品墊，以0.3-2cm左右的寬度切條。

在本發明的一種實施方式中，羊抗鼠二抗的濃度為0.5-2mg/mL，噴涂量為1-3μL/cm。

在本發明的一種實施方式中，兔IgG抗體的濃度為0.5-2mg/mL，噴涂量為1-3μL/cm。

在本發明的一種實施方式中，所述吸水紙、硝酸纖維素膜以及樣品墊依次相鄰，且相鄰部位部分重疊區域的長度為1～5mm。

在本發明的一種實施方式中，所述吸水紙與硝酸纖維素膜重疊的部分位于硝酸纖維素膜的上側。