[發明專利]一種細胞表面展示有豆殼過氧化物酶的重組酵母菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201711443855.1
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108085332B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 咸漠;王紀明;張海波;王帆;劉會洲
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/53;C12N9/08;C12N11/02;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發明提供了一種細胞表面展示有豆殼過氧化物酶的重組酵母菌及其構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發明通過設計如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并將該序列化學合成后連接到pUC57?simple載體上，然后亞克隆到pMIZY05v2表達載體上，構建重組載體pMIZY05v2?oEp，經線性化后轉化到解脂耶羅威亞酵母PO1h菌株中，得到可表面展示重組豆殼過氧化物酶的工程菌，然后在含有血紅素的PPB培養基中培養2～5d，離心收集細胞即得固定化重組豆殼過氧化物酶。利用通過簡單離心收集菌體即可得到重組豆殼過氧化物酶，可以省去過氧化酶繁瑣的分離純化步驟，簡化生產工藝，降低生產成本。

技術領域

本發明涉及一種細胞表面展示有豆殼過氧化物酶的重組酵母菌及其構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

過氧化物酶(peroxidase，EC 1.11.1.x)是一類廣泛存在于動物、植物及微生物中的氧化還原酶，通常由一條肽鏈和血紅素輔基構成(部分種類還含有Ca²⁺、Mn²⁺等其他金屬離子)，能夠以H₂O₂或過氧化有機物為電子受體催化多種底物的氧化反應。豆殼過氧化物酶(soybean hull peroxidase，ShP，EC 1.11.1.7)是一種從大豆(Glycine max)豆殼中提取獲得的過氧化物酶，屬于植物過氧化物酶超家族的第III類(分泌型過氧化物酶)，能以H₂O₂為電子受體催化氧化多種有機和無機底物。天然ShP分子量約40kDa，由304個氨基酸殘基組成，等電點3.9，是一種酸性蛋白質。ShP脫輔基蛋白基因cDNA包含一個全長1056bp的開放閱讀框，編碼含有352個氨基酸殘基的前體蛋白。前體蛋白翻譯后經過多種修飾最終才能成為有功能的全酶，前體蛋白首先切除N-末端26個信號肽，然后暴露出來的N-末端谷氨酰胺殘基環化成焦谷氨酸，之后經切除C-末端22個氨基酸殘基的酶原肽(propeptide)、糖基化修飾、結合輔因子、二硫鍵形成后才能成為成熟的功能酶。糖基化修飾約占該酶總分子量的18％，對于蛋白維持構象和防止降解有重要作用。除血紅素外結合位點外，該酶還帶有2個Ca²⁺結合位點，對于維持酶的結構和活性具有重要作用。

在第III類植物過氧化物酶中，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)因其研究較早而為人所熟知，目前廣泛應用于環保、食品添加劑、酶免疫技術、生物傳感器等多種領域。與之相比，ShP具有熱穩定好、pH適用范圍廣等多種優勢，在多種領域可完全替代HRP而獲得更廣泛的應用。如美國American Qualex和Enzymol International公司已將ShP應用于病毒、細菌、寄生蟲診斷試劑盒的生產。國內王炳全等利用ShP成功研制了H₂O₂檢測生物傳感器，具有響應時間短、檢測靈敏度高、熱穩定性好和耐儲存等多種優點。ShP用于環保行業，可催化酚、胺等有毒物質的氧化解毒。目前，國外已經有公司將ShP應用于處理工業廢水。ShP作為綠色食品添加劑可替代溴酸鉀用于面粉中類胡蘿卜素的脫色，并抑制蛋白質分解，縮短面粉的成熟期，賦予面粉更好的彈性和強度，在焙烤制品中獲得了令人滿意的效果。總之，ShP因其多種優點獲得了市場青睞。