[發明專利]一種高效獲得T-DNA插入側翼序列的方法及其應用

有效

• 申請號: 201711441201.5
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN108034695B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 鄧晟;林玲;張昕
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 上海領譽知識產權代理有限公司 31383
• 代理人: 溫愛飛

本發明涉及Transfer DNA(T?DNA)插入真核生物基因組后，其相關插入位點側翼序列信息獲得的方法及其應用，屬于生物技術研究領域。本發明在雙元質粒T?DNA區域的左邊界(Left Border)或者右邊界(Right Border)附近設計一條生物素標記的特異引物；利用該引物可以同時結合靶標序列片段以及鏈霉親和素的特性，將含有T?DNA插入的邊界核酸序列分離并純化；接著將一個已知序列的接頭連接到純化片段的5’端，并進行PCR擴增；最后將PCR序列克隆至載體測序，獲得插入序列信息。和傳統的iPCR和TAIL?PCR相比，該方法可以顯著提高鑒定T?DNA插入位點的效率和準確率。

技術領域

本發明涉及Transfer DNA(T-DNA)插入真核生物基因組后，其相關插入位點側翼序列信息獲得的方法及其應用，屬于生物技術研究領域。

背景技術

根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)能將其細胞內攜帶的Ti質粒(Tumorinducing plasmid)上的一段特殊序列，即轉移DNA(transfer DNA，簡稱T-DNA)，隨機整合至受體植物或真菌的基因組中，最終誘發受體細胞產生基因突變或者產生轉基因細胞系。目前，對于一部分植物和真菌，利用T-DNA基因組隨機插入法鑒定基因的生物學功能已經比較成熟。科研人員利用常見的iPCR法(inverse Polymerase Chain Reaction)以及TAILPCR法(Thermal asymmetric interlaced PCR)獲取T-DNA插入位點的側翼序列(即T-DNA插入基因組的位置)，然后結合已知的相關物種的基因組信息，便可以獲得對應的轉基因品系或菌株中哪些功能基因被突變。但是，上述iPCR法和TAIL-PCR法也存在局限性，它們由于過分依賴PCR，導致假陽性率較高，或者完全無法擴增到預期條帶。

iPCR法首先通過內切酶徹底切割基因組DNA，接著利用連接酶，促使被切割的片段DNA發生自環化，最后利用形成的環狀DNA上的已知序列及其特異引物，擴增已知序列邊界的未知基因組序列，最后將PCR產物進行測序。該方法受到多種因素的干擾，比如說酶切和自環化的效率、PCR引物的非特異性結合等等，這些因素導致該方法的效率和準確性不高。TAIL-PCR則是利用3條結合到已知邊界序列的特異引物，以及一條較短的簡并引物分別進行槽式PCR的擴增，最后通過測序PCR產物獲得未知序列的信息。該方法由于過分依賴于PCR，因此，如果引物設計或者PCR程序的條件不夠理想，很可能完全擴增不到預期的條帶。

生物素(biotin)廣泛分布于動、植物組織中，其分子量為244.31 Da。生物素分子有兩個環狀結構，其中I環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；II環為噻吩環。鏈霉親和素(streptavidin)是由鏈霉菌Streptomyces avidinii分泌的一種蛋白質，分子量為65kD。鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，其中每條肽鏈都能結合一個生物素，因此一個鏈霉親和素分子能結合4個生物素分子，二者親和常數(Kd)為10^-15M^-1。生物素-鏈霉親和素(biotin-streptavidin)系統由于其高度的親和性和特異性，一直被運用于免疫標記和示蹤分析領域。最近，生物素-鏈霉親和素系統也開始應用于核酸分離和純化領域，而本發明正是基于這一基礎。

發明內容

本發明根據所使用的Ti質粒序列信息，在其T-DNA區域的左邊界(Left Border)或者右邊界(Right Border)附近設計一條生物素標記的特異引物；利用該引物可以同時結合靶標序列片段以及鏈霉親和素的特性，將含有T-DNA插入的邊界核酸序列純化并富集；接著將一個已知序列的接頭連接到純化片段的5’端，并進行PCR擴增；最后將PCR序列克隆至載體測序，獲得插入序列信息。

相關技術路線如下：