[發(fā)明專利]一種生物源殺蟲劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711441106.5
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108041069A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董秋月
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州更藍(lán)生物科技有限公司
• 主分類號: A01N57/16
• 分類號: A01N57/16;A01P7/04;C12N15/113;C12N15/82
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種生物源殺蟲劑，其特征在于，所述生物源殺蟲劑包含至少一種microRNA成分。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述殺蟲劑，其特征在于，所述生物源殺蟲劑的制備方法為：獲得第一microRNA的前體序列、第二microRNA的前體序列，分別在前體序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩端約50bp處設(shè)計(jì)引物，接著以DNA為模板利用所設(shè)引物擴(kuò)增獲得第一microRNA的前體序列的多核苷酸序列、第二microRNA的前體序列的多核苷酸序列，PCR反應(yīng)體系為50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCRbuffer 5μl、10mM dNTPs 4μl、10μM正向引物0.8μl、10μM反向引物0.8μl、TaKaRa Taq聚合酶0.5μl，最后加ddH2O補(bǔ)至50μl，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃10min，4℃保存；

擴(kuò)增后將所述第一microRNA的前體序列、第二microRNA的前體序列用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，將回收的所述第一microRNA的前體序列、第二microRNA的前體序列的DNA產(chǎn)物分別與pMD19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系10μl，分別加入0.5μl pMD19-T載體、4.5μl純化的所述第一microRNA的前體序列、第二microRNA的前體序列的DNA產(chǎn)物、5μlSolution I，16℃下連接3h后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過Amp篩選，挑取陽性克隆，經(jīng)PCR反應(yīng)驗(yàn)證及測序鑒定正確后，選取正確的菌液提取連接正確產(chǎn)物的質(zhì)粒；

將所述質(zhì)粒分別和DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA2301同時(shí)用TakaRa公司生產(chǎn)的KpnI和PstI進(jìn)行雙酶切，酶切體系50μl，包括5μl 10×M buffer、28μl質(zhì)粒、1μl KpnI、1μl PstI和15μl ddH2O，37℃水浴過夜，將DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA2301和克隆質(zhì)粒酶切后，割膠回收DNA片段，接著用T4連接酶連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌液PCR，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；

將驗(yàn)證正確的植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中并用所述農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞將所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物，最終獲得轉(zhuǎn)入第一microRNA的前體序列、第二microRNA的前體序列的植物株系；

大量種植所述轉(zhuǎn)入第一microRNA的前體序列、第二microRNA的前體序列的植物，切碎后用攪拌機(jī)攪碎，將攪拌后的植物放置于濃度為75％的酒精中，攪拌均勻，獲得生物源殺蟲劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述殺蟲劑，其特征在于，所述第一microRNA為tca-mir-34、所述第二microRNA為tca-mir-92a。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述殺蟲劑，其特征在于，所述植物選自水稻、擬南芥、玉米、谷子、小麥或青稞。