[發明專利]大麗輪枝菌糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP亞細胞定位載體的構建和應用

在審

• 申請號: 201711439779.7
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN108130331A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 張昕;林玲;鄧晟
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/80
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及植物病理學領域，根據前期從大麗輪枝菌V08DF1菌株中克隆的VdGAP基因的全長序列，將其克隆到1300?ble?GFP載體，構建了針對該基因的綠色熒光標記重組載體，利用農桿菌介導的轉化方法，獲得了該基因的綠色熒光標記突變體。通過對的綠色熒光標記突變體表型觀察和分析，發現VdGAP基因表達的蛋白在孢子時期定位在細胞核，在菌絲和微菌核時期定位在細胞質。本發明在前面工作基礎上，利用GFP標記該基因，對明確微菌核形成和發育的機制以及深入研究該病害流行規律和制定防治措施具有重要意義。

技術領域

本發明涉及大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP的亞細胞定位，屬于植物病理學研究領域。

背景技術

大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起植物黃萎病的重要土傳病原真菌，寄主廣泛，可危害多種重要的經濟作物和園藝作物。傳統的防治技術，如輪作、抗性品種選育、化學藥劑等對黃萎病的防治有一定的效果，但是由于大麗輪枝菌具有豐富的遺傳多樣性，致病力易發生分化，且主要以抗逆性強的微菌核結構在土壤中存活，因而在世界范圍內黃萎病的危害依然嚴重。

黃萎病是系統性侵染的單循環病害，微菌核是大麗輪枝菌在土壤中的主要休眠結構，能夠在無寄主植物的土壤中長期存活達14年之久，成為植物黃萎病重要的初侵染來源，在病害循環中起重要作用，其形成的數量及存活情況直接影響著黃萎病的發生危害程度。對于大麗輪枝菌微菌核的研究過去集中于微菌核的形態、大小、分布，微菌核的分離培養技術以及影響微菌核存活的土壤環境因素等。對于其發育的過程在形態學層次也已清晰，最初階段是由單根或數根菌絲膨大，并產生大量的隔膜，隔膜的細胞繼續增大，成為球狀并產生側芽，最終在細胞壁內和細胞間沉積黑色素顆粒，黑色素對于形成完整的休眠結構是必須的。但對于微菌核形成和發育的分子機制并不明確。本實驗室前期通過對大麗輪枝菌糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP敲除與回補，證明該基因參與大麗輪枝菌黑色素的形成。本發明在前面工作基礎上，利用GFP標記該基因，對明確微菌核形成和發育的機制以及深入研究該病害流行規律和制定防治措施具有重要意義。

根據膜蛋白分離的難易程度及與其脂分子的結合方式，膜蛋白可分為三種基本類型：外在膜蛋白(extrinsic membrane protein)或稱外周膜蛋白(peripheral membraneprotein)、內在膜蛋白(intrinsic membrane protein)或稱整合膜蛋白(integralmembrane protein)和脂錨定膜蛋白(lipid anchored protein)。脂錨定膜蛋白是通過與之共價相連的脂分子(脂肪酸或糖脂)插入膜的脂雙分子中，而錨定在細胞質膜上，其水溶性的蛋白質部分位于脂雙層外。脂錨定膜蛋白可以分為三種類型：(1)脂肪酸結合到膜蛋白N端的甘氨酸殘基上，如與腫瘤發生相關的酪氨酸蛋白激酶的突變體v-Src；(2)由15或20個碳鏈長的烴鏈結合到膜蛋白C端的半胱氨酸殘基上，有時還有另一條烴鏈或脂肪酸鏈結合到近C端的其他半胱氨酸殘基上；(3)通過糖脂錨定在細胞質膜上，如磷脂酶C和大分子的蛋白聚糖，在不同細胞中，這類糖脂的結構有很大的不同，但都還有磷脂酰肌醇(PI)基團，因此稱為磷脂酰肌醇糖脂(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定方式，簡稱GPI錨定方式。同磷脂分子類似，同磷脂酰肌醇結合的2個脂肪酸鏈插入脂膜中。肌醇同時與長度不等的寡糖鏈相結合，最后寡糖末端的磷酸己醇胺與蛋白質共價相連，從而有效地將蛋白質結合到質膜上，GPI脂錨定膜蛋白均分布在質膜外側。糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白在原生動物到脊椎動物中都廣泛存在，在不同物種和進化中高度保守，在物種體內可作為酶、細胞表面抗原、信號受體蛋白、細胞粘合和遷移分子，并且在多種生理活動，例如發育、免疫、神經形成中發揮重要作用。糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白有一個特征，轉酰胺基酶將預成型的糖基磷脂酰肌醇錨整體連接到內質網新生蛋白的C末端。有趣的是，糖基磷脂酰肌醇部分已被證明在蛋白的亞細胞和膜劃分中發揮重要作用，進而影響它們的轉運和特殊功能。糖基磷脂酰肌醇蛋白幾乎特異性定位在細胞表面，在脂質雙分子層的外葉，因此脂類和蛋白代謝通路可能影響它們的胞內運輸。

發明內容