[發(fā)明專利]一種禽流感病毒的全懸浮培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711439115.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-27
• 公開（公告）號(hào): CN107904215B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡仕君;陳瑞愛;羅順;李延鵬;溫良海;張曉楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華農(nóng)（肇慶）生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司;肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;甘肅健順生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/02;C12N5/0735;C12N5/02
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚(yáng);付靜

本發(fā)明公開了一種禽流感病毒的全懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：步驟1：取EB66細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)；步驟2：待EB66細(xì)胞的密度生長(zhǎng)至適于接毒時(shí)，采用流加補(bǔ)液接毒工藝向EB66細(xì)胞中接種禽流感病毒，進(jìn)行病毒的增殖培養(yǎng)；步驟3：在接毒24h后，每隔12h取樣測(cè)定病毒的HA效價(jià)，在病毒HA效價(jià)達(dá)到最高時(shí)收獲病毒并保存，得到培養(yǎng)后的禽流感病毒。本發(fā)明用EB66細(xì)胞進(jìn)行禽流感病毒培養(yǎng)，避免了采用傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)工藝生產(chǎn)時(shí)易引入大量雜蛋白的缺點(diǎn)，有效降低雞只免疫副反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)提高培養(yǎng)的禽流感病毒滴度及純度，進(jìn)而提高禽流感疫苗的生產(chǎn)品質(zhì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種禽流感病毒的全懸浮培養(yǎng)方法，特別涉及一種通過全懸浮傳代細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)禽流感病毒的方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

目前，已上市的禽流感疫苗大多是通過傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)制得，國內(nèi)外應(yīng)用雞胚進(jìn)行禽流感病毒的生產(chǎn)己有許多年的歷史。該工藝簡(jiǎn)單且技術(shù)成熟，其制備工藝主要流程為：首先將種毒液接種至雞胚尿囊液中，雞胚作為一個(gè)卵細(xì)胞整體，由于組織分化程度低，不會(huì)對(duì)接種的病毒產(chǎn)生抗體，十分有利于病毒的復(fù)制；病毒在雞胚中培育一定時(shí)間后，通過收集雞胚尿囊液，得到疫苗制品的中間產(chǎn)品；經(jīng)超濾離心和濃縮后，需采用環(huán)丙內(nèi)酯或甲醛滅活，再經(jīng)裂解劑(如TritonX-100等)進(jìn)行病毒裂解，并純化HA和NA蛋白，最后根據(jù)HA蛋白所占比例來標(biāo)定疫苗濃度。

雞胚作為病毒培養(yǎng)的基質(zhì)，需要經(jīng)過嚴(yán)格工序來保證其品質(zhì)。首先，合格的雞胚除了能正常生產(chǎn)禽流感病毒外，還應(yīng)該是健康雞群產(chǎn)下的受精卵，例如SPF海蘭白雞；其次，生產(chǎn)中一般要求產(chǎn)蛋雞的年齡不超過1周年；再者，為確保雞群在生長(zhǎng)過程中沒有感染任何禽流感等相關(guān)疾病，必須經(jīng)過定期檢測(cè)，同時(shí)要嚴(yán)格確保受精卵內(nèi)不能帶有任何病毒。受到這些因素的限制，導(dǎo)致無特定病原體(Spedfic PathogenFree,SPF)的雞胚產(chǎn)量小、成本高，往往不能滿足大批量生產(chǎn)禽流感疫苗的需求。除此之外，雞胚培養(yǎng)還存在諸多問題，不同批次的雞胚質(zhì)量往往存在差異，難以控制品質(zhì)，而不同質(zhì)量的雞胚會(huì)對(duì)病毒培養(yǎng)產(chǎn)生不同副作用，且雞胚的來源容易受到禽流感疫情的影響；此外，雞胚是許多細(xì)菌的天然宿主，容易受到環(huán)境中細(xì)菌的感染，己有研究者指出由母體遺傳給雞胚所帶來的潛在污染比GMP車間無菌環(huán)境中人為操作所帶來的污染化率大很多，而這也正是雞胚培養(yǎng)過程中難以控制的地方。另外，在雞胚的尿囊液中含有大量動(dòng)物源蛋白，在提取病毒時(shí)易被帶入病毒液中，導(dǎo)致成品疫苗中有大量動(dòng)物源蛋白，從而引起過敏反應(yīng)等副作用。

目前采用傳代細(xì)胞系MDCK細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)禽流感病毒疫苗的技術(shù)已經(jīng)越來越趨向于成熟，甚至已經(jīng)達(dá)到了全懸浮大規(guī)模生產(chǎn)的水平，MDCK細(xì)胞雖可高密度懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)的禽流感病毒滴度可達(dá)到雞胚水平，但是免疫原性與動(dòng)物副反應(yīng)一直是使用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒疫苗的技術(shù)壁壘。與雞胚相比，同等血凝價(jià)時(shí)，采用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的禽流感病毒免疫雞體后產(chǎn)生的抗體水平低，副反應(yīng)嚴(yán)重，且MDCK細(xì)胞能在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生，存在致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致疫苗的使用安全性較低，這對(duì)于疫苗的安全性來說是一個(gè)致命的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供用全懸浮傳代細(xì)胞系EB66細(xì)胞生產(chǎn)禽流感H9亞型病毒的方法，該方法具有生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、易操作，病毒含量高、批間差異小、質(zhì)量易控的優(yōu)點(diǎn)，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量，使用該方法生產(chǎn)出的禽流感疫苗安全性好、免疫效力高。

本發(fā)明的目的在于提供一種禽流感病毒的全懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1：取EB66細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)；

步驟2：至EB66細(xì)胞的密度生長(zhǎng)至適于接毒時(shí)，采用流加補(bǔ)液接毒工藝向EB66細(xì)胞中接種禽流感病毒，進(jìn)行病毒的增殖培養(yǎng)；

步驟3：在接毒24h后，每隔12h取樣測(cè)定病毒的HA效價(jià)，在病毒HA效價(jià)達(dá)到最高時(shí)收獲病毒并保存，得到培養(yǎng)后的禽流感病毒。

進(jìn)一步地，所述步驟2的具體操作方式如下：