[發明專利]一種定點標記的泛素特異性蛋白酶7及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711436434.6
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN109957559A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 金宗文;楊偲;袁靜;羅擎穎;劉琳
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明公開了一種定點標記的泛素特異性蛋白酶7及其制備方法和應用，所述泛素特異性蛋白酶7進行定點突變后，采用帶有標記基團的非天然氨基酸進行定點標記，其中，所述帶有標記基團的非天然氨基酸通過tRNA合成酶/tRNA對引入；本發明通過優化蛋白表達流程，選擇特定的標簽及表達載體，并通過tRNA合成酶和tRNA對引入非天然氨基酸，各步驟各條件協同增效，提高了蛋白的表達量并完成了定點標記，操作簡便，易于推廣，不影響蛋白酶7的結構和活性，具有廣闊的應用前景和巨大的市場價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種定點標記的泛素特異性蛋白酶7及其制備方法和應用。

背景技術

泛素廣泛存在于真核生物中，在細胞生理生化過程中扮有重要作用。在各級泛素酶的催化作用下，泛素分子可以對靶蛋白進行特異性的翻譯后修飾叫做泛素化。泛素化是蛋白質翻譯后修飾的一個重要途徑，通過2到4個級聯酶特異性修飾靶蛋白的穩定性、定位和活性。與之相反，泛素化過程能被去泛素化酶逆轉，稱為去泛素化，即通過切除單聚和多聚泛素來對抗泛素化作用，從而提供一個額外水平的翻譯后調控。去泛素化酶能特異性地水解泛素C-末端與靶蛋白之間形成的酯鍵、肽鍵或異肽鍵，使泛素脫離靶蛋白，從而參與調控細胞周期進程、蛋白質降解、基因表達、DNA修復及細胞凋亡等方面起著重要作用。

泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases，USPs)是目前已知的去泛素化酶家族中成員最多、結構最具多樣性的一類，廣泛參與到細胞周期、癌基因和抑癌基因等有關蛋白的調節中。異常的去泛素化活性與許多疾病有關，包括癌癥。泛素特異性蛋白酶7(USP7)也稱為皰疹病毒屬伴隨的泛素特異性的蛋白酶(Herpesvirusassociatedubiquitin specific protease，HAUSP)，是這個家族的重要成員之一。人類USP7由1102個氨基酸組成，而鼠USP7由1103個氨基酸組成，分子量約為135kDa。USP7包括四個結構域，N-氨基末端TRAF區域、催化區域及64kDa的C-羧基末端區域等三個區域現已經被鑒別出來。N-氨基末端TRAF區域負責直接與底物蛋白(如p53、MDM2等)相結合，主要影響蛋白和蛋白之間的相互作用。催化區域包含兩個高度保守的組氨酸盒和半胱氨酸盒，是泛素蛋白酶家族的重要特征。泛素結合袋位于催化區，而泛素結合袋的形成，可以激活USP7，從而促使USP7與泛素相結合，起到去泛素化的作用。C-羧基末端區域含有兩個泛素連接酶，能與泛素相互作用，以及5個連續的類泛素區(Ubl)。它起初作為一個單純皰疹病毒蛋白感染的細胞蛋白0(ICP0)的綁定伴侶被鑒別出來。繼而，許多潛在的底物和綁定分子被鑒別出來。其中，泛素特異性蛋白酶7的一些更具特征的底物在腫瘤抑制、DNA修復、免疫反應、病毒復制和表觀遺傳控制等方面有重要作用。