[發(fā)明專利]一種靶向腫瘤多種KRAS突變抗原表位的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711429033.8
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN109957582A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李晨蔚;劉平磊
• 申請（專利權(quán)）人: 上海尚泰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及靶向多種KRAS突變抗原表位的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法。本發(fā)明方法將7個(gè)主要KRAS突變抗原表位序列經(jīng)串聯(lián)組合而成的新的人工抗原編碼序列，克隆到慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染DC，刺激激活CD8+T細(xì)胞的增殖和分化，使得最終制備得到的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)具有靶向7個(gè)主要KRAS突變抗原表位的特異性。本發(fā)明制備的KRAS突變抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，具有靶向特異性強(qiáng)、無副作用和不易引起免疫逃逸等優(yōu)點(diǎn)，在KRAS突變腫瘤的治療中具有極大的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用研究領(lǐng)域，具體涉及靶向多種KRAS突變抗原表位的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法。

背景技術(shù)

KRAS屬于RAS基因家族重要成員，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的“分子開關(guān)”，在MAPK(RAS-RAF-MEK-ERK)和PI3K(PI3K-AKT-mTOR)信號(hào)傳導(dǎo)通路中起重要的調(diào)控作用，參與一系列基本的生物過程，包括細(xì)胞增殖、生存和分化(Jancik et al.，2010)。但當(dāng)KRAS發(fā)生突變時(shí)，其不能被水解酶水解失活，而處于持續(xù)激活狀態(tài)，致使下游信號(hào)持續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而造成細(xì)胞過度生長、增殖，并促發(fā)人類多種致死性腫瘤。時(shí)至今日，KRAS突變已存在于大約30％的人類癌癥中，其中在多個(gè)癌癥中有常態(tài)化趨勢，特別是胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌，其突變率分別高達(dá)90％、45％和35％。KRAS被激活最常見的方式為基因點(diǎn)突變，多發(fā)生在第12、13、61和146號(hào)密碼子，常見突變位點(diǎn)為12和13號(hào)密碼子，其中7個(gè)突變熱點(diǎn)：G12D、G12V、G13D、G12C、G12A、G12S和G12R，依次分別為突變概率最高的熱點(diǎn)，占所有KRAS突變的98.5％以上(Prior et al.，2012)。

大量臨床結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KRAS突變對多種惡性腫瘤患者預(yù)后不利，例如KRAS突變會(huì)導(dǎo)致肺癌靶向藥物EGFR-TKIs類發(fā)生原發(fā)耐藥，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者對靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療的預(yù)后變差。相比于KRAS野生型的患者，KRAS突變的患者生存期明顯縮短(Jancik et al.，2010)。

目前已知的RAS基因家族共有三個(gè)基因KRAS、NRAS和HRAS在人類腫瘤中存在突變，其中KRAS突變最為常見，約占85％左右。RAS基因突變，已成為目前世界上最難對付的基因突變。RAS作為一個(gè)非常重要的原癌基因，其實(shí)是一個(gè)非常理想的藥物靶點(diǎn)。然而，目前針對該基因還沒有行之有效的靶向藥物。曾經(jīng)多個(gè)RAS靶向藥物都相繼失敗了，相比于EGFR抑制劑已經(jīng)開發(fā)到第四代，RAS到目前為止還沒看到有希望的靶向藥被批準(zhǔn)上市。其中一個(gè)最主要原因在于對RAS的功能以及RAS突變致癌的機(jī)理目前仍然沒有完全闡明清楚，另外想要設(shè)計(jì)和開發(fā)出一種針對所有RAS突變都有效的藥物也幾乎是不可能的，因此，只能尋找針對特定突變的靶向藥物，但這仍將任重而道遠(yuǎn)。

腫瘤細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，并逐漸被認(rèn)為是一種行之有效的治療方法。免疫治療通過觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)，對腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)產(chǎn)生反應(yīng)并攻擊腫瘤細(xì)胞，是腫瘤治療領(lǐng)域最有前景的治療方法，成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種腫瘤治療策略。