[發明專利]紫芝黑豆溶栓酶的制備方法

在審

• 申請號: 201711428509.6
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108048431A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 程京燕;蘇保榮;高向陽
• 申請（專利權）人: 珠海市微豆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍

本發明公開的紫芝黑豆溶栓酶的制備方法，以紫芝為生產菌株，以黑豆為培養基，采用固態發酵的方法，其紫芝溶栓酶有強烈的溶血栓活性，活性中心存在絲氨酸殘基，為絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶屬，是一種新發現的溶栓酶，具有提高免疫力的功效，并適用于免疫力低及其引起的癥狀；既保留了黑豆的營養成份，使用后又可增強人體腸道功能，具有很好的經濟效益和市場前景。

【技術領域】

本發明涉及一種溶栓酶的制備方法及豆類發酵制品的深加工領域，尤其是一種紫芝黑豆溶栓酶的制備方法。

【背景技術】

紫芝，真菌的一種。似靈芝。應用范圍非常廣泛，無論心、肺、肝、脾、腎臟虛弱，均可服用。紫芝所治病種涉及呼吸、循環、消化、神經、內分泌及免疫等各個系統；涵蓋內、外、婦、兒、五官各科疾病。紫芝化學成分為子實體及菌絲體，含蛋白質、氨基酸、糖類、香豆素、甾體及三萜化合物。子實體并含油脂、蠟、揮發性及升華性物質。性淡、溫，味稍苦，能補中強智、寧心益胃，用于神經衰弱、失眠、胃痛、消化不良、解菌毒，有一定的抗癌作用。

黑豆為豆科植物大豆(學名：Glycinemax(L.)merr)的黑色種子。黑豆又名櫓豆、黑大豆等。黑豆具有高蛋白、低熱量的特性，外皮黑，里面黃色或綠色。黑豆性喜溫暖，耐高溫，生育適溫18～30度，播種法繁殖以顆粒大而飽滿、色澤烏黑發亮者為佳。根據中國科學家的一項研究發現，黑豆防老抗衰，藥食俱佳，它與黃豆同屬大豆類，黑豆皮提取物能夠提高機體對鐵元素的吸收，帶皮食用黑豆能夠改善貧血癥狀。

目前，血栓栓塞性疾病，如腦血栓、心肌梗塞、冠心病、肢體血管栓塞等的發病率呈上升趨勢，其致殘率和死亡率都很高，是危害人類健康和生命的主要疾病之一。造成血栓栓塞性疾病的主要原因之一是由于血管內形成血栓。

治療血栓栓塞性疾病的主要方法有手術、服用抗凝劑、注射溶栓劑等三種方法。目前，臨床上所用的溶栓劑主要是鏈激酶和尿激酶，但這兩種藥物都具有局限性：鏈激酶。人體內易產生鏈激酶抗體，因此存在拮抗作用，不但用量不好控制，而且還有副作用；尿激酶雖然無明顯的抗原性，但因尿激酶不穩定、活性難以控制，容易引起大出血或者因失活而起不到溶解血栓的作用。

【發明內容】

本發明提供一種應用于治療血栓栓塞性疾病的紫芝黑豆溶栓酶的制備方法。

為了實現上述目的，本發明提供的紫芝黑豆溶栓酶的制備方法，包括以下步驟：

包含紫芝黑豆的固態發酵過程和酶的分離純化過程；

其中，紫芝黑豆的固態發酵過程包括：

①菌種活化

將紫芝菌絲體均勻涂布在斜面培養基表面培養；

②種子培養

將黑豆勻漿加水煮沸，制成種子培養基，將步驟①中獲得的活化紫芝菌種接種至種子培養基搖瓶培養；

③將黑豆制成固體發酵培養基；

④發酵產酶

將步驟②獲得的種子培養基接種至步驟③獲得的固體發酵培養基獲得固體發酵物料；

酶的分離純化過程包括：

i、酶的分離

取紫芝黑豆的固態發酵過程中獲得的固體發酵物料，加入0.1～0.2mol/L、pH7～8的磷酸鈉緩沖液從發酵物料中提取酶，其液比是1∶3～6，攪拌2～4小時后，離心、取上清液為粗酶液；

ii、酶的純化

將步驟i獲得的粗酶液進行Sephadex G-50柱層析和CMC離子交換柱層析，用離子強度pH線性梯度洗脫，收集具有溶栓酶活性的洗脫液部分，獲得純化的紫芝黑豆溶栓酶。