[發明專利]一種重組酶聚合酶恒溫擴增結合試紙條檢測單增李斯特菌的方法和應用

在審

• 申請號: 201711428077.9
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108148894A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 任士常;張志紅
• 申請（專利權）人: 中科智測(天津)科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04;G01N33/569
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明公開了一種重組酶聚合酶恒溫擴增結合試紙條檢測單增李斯特菌的方法，步驟如下：選取hlyA基因作為檢測靶基因，設計對單增李斯特菌具有特異性的引物對，以單增李斯特菌基因組DNA為模板，進行特異性恒溫擴增，并應用膠體金試紙條獲得檢測結果。本方法快速簡便，特異性強，靈敏度高，可重復性高，該方法在39℃下恒溫擴增僅需10分鐘，膠體金試紙條檢測結果5分鐘以內，檢測結果肉眼觀察，整個反應過程不需要昂貴實驗儀器，只需一個恒溫儀器，可以應用于偏遠、資源貧乏地區和現場檢測。該方法有望成為簡易的常規檢測手段，對保證食品安全有重要意義。

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，涉及針對單增李斯特菌的恒溫擴增快速檢測技術，尤其是一種重組酶聚合酶恒溫擴增(RPA)結合試紙條檢測單增李斯特菌的方法和應用。

背景技術

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)廣泛存在于自然界中，易污染肉類、奶類、海產品和蔬菜等，由于其易形成生物被膜，使它在食品中存活更長的時間。世界衛生組織在有關食物中毒報告中指出4％一8％的海產品、5％一10％的奶及制品和30％以上的肉制品存在單增李斯特菌污染。而且，由于該菌在4℃冰箱保存的食物中也可生長繁殖，使潛在的危害性進一步增大。食用被單增李斯特菌污染的食物除了會出現惡心、敗血、腹瀉等一般細菌性食物中毒癥狀外，還會導致心肌炎、腦膜炎、腸胃炎和肺炎等。在1986年WHO和FDA設立了李斯特菌研究中心，專門協調該菌的病原學、流行學及臨床等研究工作，該菌已被列為90年代四大食品致病菌之一。在歐美、日本由單增李斯特菌造成的臨床疾病和食物污染問題，在細菌性食物中毒中占第一位。因此現在世界各國都把單增李斯特菌列為食品衛生的法定檢測項目。

目前單增李斯特菌的檢測方法主要包括細菌分離鑒定、免疫學方法、分子生物學方法等。細菌分離鑒定工作量大，成本較低，但檢測周期長，靈敏度低；免疫學方法易交叉污染，假陽性嚴重，靈敏度偏低；分子生物學方法應用最廣泛的是PCR，但操作繁瑣耗時，必須依賴昂貴的實驗設備，不便于在基層或現場檢測進行推廣。

近年來，重組酶聚合酶(RPA)方法受到關注，該方法是一種新型核酸擴增技術，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術，自2006年問世后，已應用于農業、食品安全、醫學和轉基因檢測等多個領域。可在恒溫條件下(37℃～42℃)實現對核酸的快速、特異性擴增，且在20min內可將核酸擴增至可檢測水平，具有良好的可操作性，被認為是最接近所謂的“等溫擴增”，具有廣闊的應用前景。膠體金試紙條(LF)最大的特點是快捷迅速、靈敏準確、安全簡便、成本低廉且不需要專業人員和儀器設備，通常幾分鐘內就可用肉眼觀察到的檢測結果。

通過檢索，尚未發現與本發明申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種重組酶聚合酶恒溫擴增結合試紙條檢測單增李斯特菌的方法和應用，該方法具有高靈敏度、高特異性、可視化、操作簡單、便攜式的特點。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：

一種重組酶聚合酶恒溫擴增結合試紙條檢測單增李斯特菌的方法，步驟如下：

選取hlyA基因作為檢測靶基因，設計對單增李斯特菌具有特異性的引物對，以單增李斯特菌基因組DNA為模板，進行特異性恒溫擴增，并應用膠體金試紙條獲得檢測結果。

而且，所述引物對為：

正向引物的核苷酸序列SEQ1：GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG；

反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA。

而且，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin標記，所述反向引物的5’端用生物素biotin標記。