[發(fā)明專利]一種牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711427088.5
• 申請(qǐng)日: 2017-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN108196064A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏成;趙暢;張江;吳凌;白云龍;范子玲;徐闖;張洪友
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/64
• 代理公司: 成都正華專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51229
• 代理人: 何凡

1.一種牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：酶標(biāo)板、包被緩沖液、洗液、封閉液、牛PON1單克隆抗體、牛PON1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、顯色液和終止液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包被緩沖液為0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸緩沖液；顯色液為TMB顯色液；終止液為3mol/L的H₂SO₄溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，洗液由吐溫-20與濃度為0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸緩沖液按體積比為1:2000混合配制而成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，封閉液是用1×PBS溶液稀釋脫脂奶粉，使其濃度為5％，制得。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，牛PON1單克隆抗體通過以下方法制備得到：采用純化的牛PON1蛋白免疫鼠，得到達(dá)到要求效價(jià)的血清，并將其與雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后，經(jīng)過四次克隆篩選出的陽性細(xì)胞株，將細(xì)胞株注入鼠腹腔，經(jīng)大量培養(yǎng)后收集，純化，制得。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，牛PON1多克隆抗體通過以下方法制備得到：采用純化的牛PON1蛋白免疫兔，得到達(dá)到要求效價(jià)的多抗血清，然后進(jìn)行純化，制得。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，牛PON1蛋白通過以下方法制備得到：提取牛DNA，利用雙酶切法對(duì)DNA進(jìn)行剪切，獲得目的基因，用T4連接酶將目的基因與質(zhì)粒連接，同時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞，然后將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后收集細(xì)菌，進(jìn)行純化，制得。

8.一種牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行如下操作：

(1)包被：用包被緩沖液將牛PON1多克隆抗體稀釋后加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加100μl進(jìn)行包被，包被完成后用洗液沖洗酶標(biāo)板2-3min，重復(fù)沖洗3-5次，拍干酶標(biāo)板；

(2)封閉：向步驟(1)拍干的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入100μl封閉液進(jìn)行封閉，封閉完成后用洗液沖洗酶標(biāo)板2-3min，重復(fù)沖洗3-5次，拍干酶標(biāo)板；

(3)加樣：將牛血清樣品按照每孔100μl的量加入步驟(2)拍干后的酶標(biāo)板孔中，置于37℃保溫1h后取出，用洗液沖洗酶標(biāo)板2-3min，重復(fù)沖洗3-5次，拍干酶標(biāo)板；

(4)添加捕獲抗體：將牛PON1單抗用1×PBS溶液稀釋，然后加入步驟(3)拍干后的酶標(biāo)板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液沖洗酶標(biāo)板2-3min，重復(fù)3-5次，拍干酶標(biāo)板；

(5)添加酶標(biāo)抗體：用1×PBS溶液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，然后加入步驟(4)拍干后的酶標(biāo)板中，每孔100μl，置于37℃孵育1h后取出，用洗液沖洗酶標(biāo)板2-3min，重復(fù)3-5次，拍干酶標(biāo)板；

(6)顯色：向步驟(5)拍干后的酶標(biāo)板中加入顯色液，每孔100μl，置于37℃避光顯色10min；

(7)終止：向酶標(biāo)板孔中加入50μl終止液終止顯色反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中用包被緩沖液將牛PON1多克隆抗體稀釋800倍，包被條件為4℃過夜；步驟(2)中封閉條件為4℃過夜。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的牛PON1蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)中將牛PON1單抗用1×PBS溶液稀釋為3.2μg/ml，步驟(5)中用1×PBS溶液將辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG稀釋40000倍。