[發(fā)明專利]水稻除草劑抗性ALS突變型蛋白、核酸及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711421905.6
• 申請(qǐng)日: 2017-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN107964543B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張保龍;王金彥;凌溪鐵;陳天子
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/46;A01H6/82;A01H6/60;A01H6/20;A01N25/32;A01N43/50;A01P13/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發(fā)明公開了一種除草劑抗性ALS突變型蛋白，所述ALS突變型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一種突變：其對(duì)應(yīng)于水稻ALS第627位氨基酸由絲氨酸變?yōu)榱涟彼?，或，其?duì)應(yīng)于水稻ALS第627位氨基酸由絲氨酸變?yōu)榘腚装彼?。本發(fā)明還公開了所述的核酸以及表達(dá)盒、重組載體或細(xì)胞在植物抗除草劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過在田間噴施ALS抑制劑類除草劑“百壟通”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分別含有本發(fā)明的兩種具有除草劑抗性的ALS突變型蛋白的水稻3?4葉幼苗在施用3.3 mL百壟通/L水后，植株仍然正常生長發(fā)育和結(jié)實(shí)，而野生型水稻3?4葉幼苗在施用1 mL百壟通/3L水30天后表現(xiàn)為整株死亡。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物蛋白和植物抗除草劑領(lǐng)域，涉及使植物具有除草劑抗性的水稻ALS 突變型蛋白、基因及其應(yīng)用；具體而言，本發(fā)明涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突 變蛋白，該蛋白能賦予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的特性。本發(fā)明 公開了該蛋白的序列，以及它們?cè)谥参锟钩輨╊I(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

雜草是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的不利因素。與傳統(tǒng)依靠栽培措施、人工除草和機(jī)械 除草等方法相比，化學(xué)除草劑的使用是一種高效的、簡便的和經(jīng)濟(jì)的治理雜草方法。

目前，以乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑氯磺隆，成為雜草防治技術(shù)和除草劑發(fā)展中的一大突破。該類除草劑使農(nóng)田除草劑的用量大為減少，具有生物活性高、殺草譜廣、 選擇性強(qiáng)、對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)已開發(fā)的ALS抑制劑主要有磺酰脲類、咪唑 啉酮類、磺酰脲類、嘧啶水楊酸類三唑并嘧啶類、嘧啶硫代笨甲酸酯類等。雖然ALS 抑制劑優(yōu)點(diǎn)突出，但該類除草劑作用位點(diǎn)單一，雜草極易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性。隨著除草劑 長期、高頻率和大面積使用，隨之出現(xiàn)的雜草抗藥性問題也日趨嚴(yán)重。

乙酰乳酸合成酶(ALS)(也稱乙酰羥酸合成酶，AHAS；EC 4.1.3.18)是支鏈氨基 酸纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸合成途徑中第一階段的一種關(guān)鍵酶，它可催化兩分子的丙 氨酸縮合產(chǎn)生CO2及α-乙酰乳酸，進(jìn)一步合成纈氨酸與亮氨酸。另外，可催化一分子 丙氨酸與一分子α-丁酮酸縮合，產(chǎn)生CO2及α-乙酰-α-羥基丁酸，促使異亮氨酸的合成。 ALS抑制劑是通過對(duì)乙酰乳酸合成酶的抑制而阻斷直鏈氨基酸的生物合成，影響蛋白質(zhì) 的合成，進(jìn)一步抑制細(xì)胞分裂，導(dǎo)致植物組織失綠、黃化，植株生長受到抑制，最后逐 漸死亡，從而達(dá)到化學(xué)除草的目的。另外，雜草被施用ALS抑制劑后，雜草體內(nèi)2-酮 丁酸的積累干擾了雜草蛋白的合成和光合作用產(chǎn)物的運(yùn)輸，也是導(dǎo)致雜草死亡的一個(gè)原 因。

ALS抑制劑類除草劑具有選擇性強(qiáng)、殺草譜廣、低毒高效等特點(diǎn)，目前已大面積推廣使用。但這些除草劑對(duì)一般不具有抗(耐)除草劑特性的農(nóng)作物本身也產(chǎn)生藥害，極 大限制了其使用時(shí)間和使用空間，如需要在農(nóng)作物播種前一段時(shí)間使用除草劑才能避免 農(nóng)作物遭受藥害。培育抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用范 圍。

目前，抗ALS抑制劑類的作物主要限于抗咪唑啉酮類和抗磺酰脲類。其中所有抗咪唑啉酮類的作物均是通過誘變與組織培養(yǎng)而成。在水稻中已知的抗ALS抑制劑突變位 點(diǎn)包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、Trp 548、Ser 627、Ser 653和Gly 654。ALS突變體抗 除草劑水平與ALS氨基酸突變的位置有關(guān)，還與突變后的氨基酸種類及突變氨基酸的 數(shù)目有關(guān)。

目前，ALS抑制劑類除草劑的作用機(jī)理尚未確定，很難提前預(yù)測ALS蛋白其它氨基酸位點(diǎn)的突變是否會(huì)產(chǎn)生除草劑抗性，只能依賴于科研人員長期、艱苦的實(shí)踐探索，并 憑借一些運(yùn)氣才可能發(fā)現(xiàn)ALS蛋白新的除草劑抗性位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供使植物具有除草劑抗性的ALS 突變型蛋白。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了編碼該ALS突變型蛋白的核酸以及表達(dá)盒、載 體和細(xì)胞等。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應(yīng)用。