[發明專利]長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201711418771.2
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108003233B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 宋林生;劉宇;王偉林;宋小瑞;王玲玲
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

本發明公開一種長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP?2，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制備方法依次按照如下步驟進行：用引物P1和P2對長牡蠣CgDM9CP?2基因編碼區片段進行PCR擴增；將PCR擴增產物與pET?30a載體經Nde1和Xho1酶切后通過連接酶連接，轉化，測序鑒定重組子；將上述重組子轉入大腸桿菌Transetta（DE3）表達菌株中進行誘導培養，而后純化、復性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白。長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP?2可應用于制備抑制畢赤酵母菌藥物。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2、制備方法及應用。

背景技術

長牡蠣是一種重要的海水養殖貝類。由于長牡蠣缺乏適應性免疫防御系統，主要依賴固有免疫系統抵御外源病原微生物的侵染，因此細菌、真菌和病毒引起的多種疾病在長牡蠣的養殖群體中不斷爆發，造成了巨大的經濟損失。包含DM9結構域的蛋白首先在果蠅中被發現。之后，Magalhaes等在魚類中發現了一些具有DM9結構域的毒素，并將其命名為“natterin”，此類毒素含有N-端的DM9結構域和C-端毒素/細菌毒素（ETX/MTX2）結構域。natterin可以在人體組織中產生細胞毒性作用，從而導致細胞壞死、水腫、局部疼痛等現象。最新的研究表明，natterin具有穿孔素的功能。近幾十年中，越來越多的含有DM9結構域的蛋白質（DM9CPs）在包括節肢動物、扁形動物等無脊椎動物中被發現，并且證明DM9CPs參與機體的免疫反應。例如，在岡比亞按蚊中，一種名為“引起瘧原蟲唾液腺反應”的DM9CPs(PRS1) ，唾液腺側葉上的表達量在瘧原蟲入侵后顯著升高，并隨感染孢子蟲數量的增加而增加。

但是，迄今為止并沒有關于長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2、制備方法及在制備抑制畢赤酵母菌藥物中應用的相關報道。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2、制備方法及應用。

本發明的技術解決方案是：一種長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一種上述長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2的制備方法，其特征在于依次按照如下步驟進行：

a. 用引物P1和P2對長牡蠣CgDM9CP-2基因編碼區片段進行PCR擴增；

b. 將PCR擴增產物與pET-30a載體經Nde1和Xho1酶切后通過連接酶連接，轉化，測序鑒定重組子；

c. 將上述重組子轉入大腸桿菌Transetta（DE3）表達菌株中進行誘導培養，而后純化、復性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重組蛋白。

一種上述長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2在制備抑制畢赤酵母菌藥物中的應用。

本發明利用體外重組表達技術獲得了長牡蠣含DM9結構域的蛋白CgDM9CP-2，該重組蛋白具有結合Mannose、LPS和PGN的生物學活性，同時在機體外對畢赤酵母菌具有較強的抑制作用。本發明的長牡蠣含DM9結構域的蛋白CgDM9CP-2作為一種有效的模式識別受體，在制備抗菌類藥物、新型免疫制劑以及飼料添加劑等方面具有應用價值。

附圖說明

圖1是本發明長牡蠣含DM9結構域蛋白CgDM9CP-2與LPS、PGN、Mannose的結合活性示意圖。