[發(fā)明專利]一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備及應用

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• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108103148A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 曹文彬;周冰樸;溫維佳
• 申請（專利權）人: 惠州清水灣生物材料有限公司
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 潘麗君

1.一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1，LNA探針序列修飾：miRNA捕獲探針序列引入鎖鏈核酸LNA，所述miRNA捕獲探針序列的末端修飾了雙硫鍵，即得含雙硫基序列修飾的LNA探針序列溶液；

S2，納米金屬陣列排布：所述納米金屬陣列由將貴金屬加工成帶有納米尺寸尖端或間隙的結構陣列排列組成所述納米金屬陣列按照固定行間距和列間距分布排列，所述行間距范圍為50～1000nm，所述列間距范圍為50～1000nm；

S3，LNA探針序列雙硫基還原：將步驟S1制備的含雙硫基序列修飾的LNA探針序列溶液與3（2-羧乙基）膦鹽酸鹽TCEP溶液混合后，將LNA探針中的雙硫基還原成巰基，即得含巰基的LNA探針序列溶液；

S4，LNA探針錨定：所述步驟S3含巰基的LNA探針序列溶液加入步驟S2制備得到的納米金屬陣列上，室溫靜置反應至少1小時后，用去離子水沖洗干凈，即得LNA探針。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備方法，其特征在于：所述步驟S1中所述的鎖鏈核酸LNA捕獲探針序列長度為18～25個核苷酸。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備方法，其特征在于：所述步驟S2中所述的納米金制備步驟如下：

S'1，納米金屬刻模：板材表面上旋涂光刻膠，所述光刻膠通過電子束曝光蝕刻出圖形，所述圖形呈鏡像對稱，并顯影、定影，即得納米陣列模具；

S'2，金屬濺射成型：所述步驟S'1的納米陣列圖案上依次真空濺射一層金屬鈦和一層貴金屬；

S'3，光刻膠剝離：通過溶劑剝離光刻膠步驟,所述步驟S'2中沉積在光刻膠上的金屬層隨光刻膠一起剝離，沉積在石英或玻璃基底上的金屬鍍層則得到保留,即得納米金屬圖案保留在板材表面上。

4.根據(jù)權利要求3所述的一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備方法，其特征在于：所述步驟S'1所述的板材的材質為石英或透明玻璃。

5.根據(jù)權利要求3所述的一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備方法，其特征在于：所述步驟S'2中所述鈦層厚度范圍為3～5nm，所述金層厚度范圍為20～40nm。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種miRNA超敏檢測用探針液體芯片的制備方法，其特征在于：所述步驟S3中所述LNA探針序列溶液加入過量的三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽TCEP溶液混合，所述LNA探針序列溶液濃度≥10μmol/L，所述三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽TCEP溶液濃度≥10μmol/L。

7.一種miRNA快速超敏檢測用探針液體芯片的檢測方法，其特征在于：采用權利要求1-6中任一項所述的LNA探針，

測試樣品溶液通過1個或多個微流道滴加到預埋在每個微流道內的LNA探針陣列上，并掃描滴加在LNA陣列上的樣品的吸收光譜。

8.根據(jù)權利要求7所述的一種miRNA快速超敏檢測用探針液體芯片的檢測方法，其特征在于：所述的吸收光譜的測量采用透射譜測量方法進行掃描。

9.根據(jù)權利要求8所述的一種miRNA快速超敏檢測用探針液體芯片的檢測方法，其特征在于：所述透射譜測量法采用線偏振光源掃描滴加在LNA陣列上的樣品吸收光譜。

10.根據(jù)權利要求7至9任一項權利要求所述的一種miRNA快速超敏檢測用探針液體芯片的清洗再生方法，其特征在于：所述LNA探針測試使用后置于氫氧化鉀溶液和雙氧水混合溶液中加熱至50～65℃，恒溫浸泡1小時，所述氫氧化鉀溶液濃度為40～60mmol/L，所述雙氧水濃度為20%～30%，所述氫氧化鉀與雙氧水混合比例為1:2～1:3。