[發(fā)明專利]一種MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711407812.8
• 申請(qǐng)日: 2017-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107868771A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李莉;趙海源;陳宏;王玉紅;馮玉強(qiáng);蔣曉梅;張?zhí)焓?/a>;朱長(zhǎng)動(dòng);楊柳;張麗娜;杜鑫;唐東雪;趙丹;劉金偉;曾曉敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林冠界生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/02;A01N1/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11371
• 代理人: 李進(jìn)

1.一種MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

MDCK細(xì)胞用胎牛血清含量為8％的DMEM/F12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3次；

用胎牛血清含量為5％的DMEM/F12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5次；

用胎牛血清含量為2％的DMEM/F12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5次；

用DMEM/F12培養(yǎng)基與低血清培養(yǎng)基按照體積比為1:1混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中新生牛血清含量為2％，傳代培養(yǎng)7次；

用DMEM/F12培養(yǎng)基與低血清培養(yǎng)基按照體積比為1:5混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中新生牛血清含量為2％，傳代培養(yǎng)6次；

用低血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5次；

消化、離心，得到的細(xì)胞用低血清培養(yǎng)基以轉(zhuǎn)速為20-30r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測(cè)定葡萄糖含量，低于1g/L進(jìn)行換液，待細(xì)胞比生長(zhǎng)速率穩(wěn)定后，每次傳代前密度調(diào)整為約4.8×10⁵-5.2×10⁵cells/ml，并逐步提高搖床轉(zhuǎn)速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的細(xì)胞，即為低血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株；

收集細(xì)胞，然后采用低血清培養(yǎng)基與無(wú)血清培養(yǎng)基的混合液培養(yǎng)，并逐步提高無(wú)血清培養(yǎng)基的含量，生長(zhǎng)穩(wěn)定后，得到無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，以轉(zhuǎn)速為20-30r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞密度為0.8×10⁶-1.2×10⁶cells/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，逐漸提高轉(zhuǎn)速為每次提高轉(zhuǎn)速20-30r/min，每次轉(zhuǎn)速適應(yīng)培養(yǎng)3-5代。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，最終轉(zhuǎn)速提高到80r/min，傳代5次以上培養(yǎng)，得到低血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，逐步提高無(wú)血清培養(yǎng)基的含量具體為：

首次是低血清培養(yǎng)基與無(wú)血清培養(yǎng)基以4:1混合的培養(yǎng)液，然后低血清培養(yǎng)基與無(wú)血清培養(yǎng)基依次按照2:1、1:2、0:1進(jìn)行配比。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，添加無(wú)血清培養(yǎng)基后，細(xì)胞密度調(diào)整至1.8×10⁶-2.2×10⁶cells/ml進(jìn)行搖床培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為80r/min。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，添加無(wú)血清培養(yǎng)基后，每次培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變適應(yīng)培養(yǎng)8代以上。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞還包括凍存的步驟。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的MDCK懸浮細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述凍存采用的凍存液為DMSO：蔗糖：無(wú)血清培養(yǎng)基以質(zhì)量比為1:2:7混合而成。