[發明專利]一種體外活化擴增自然殺傷細胞的方法

有效

• 申請號: 201711403438.4
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108004211B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 張滌平;郭子寬;葛四海;錢開誠;劉家權
• 申請（專利權）人: 深圳市賽歐細胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 廣州匯航專利代理事務所(普通合伙) 44537
• 代理人: 呂詩

本發明屬于生物醫藥領域，尤其是涉及一種NK細胞的體外活化擴增培養方法。在激活劑預處理中，是在培養瓶中加入激活劑和PBS進行混合后，所述激活劑含有0.10mg?100.00mg/ml的透明質酸和0.1μg?20μg/ml的CD16抗體，激活劑和PBS的體積比為1:40；活化處理，吸除激活劑，然后加入生理鹽水，輕晃培養瓶，最后吸除生理鹽水,得到已包被的培養瓶。在培養單個核細胞時向培養基中添加GM?CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)，使其終濃度在0.05μg?1.00μg/ml之間。相比于已有的專利方法，更為簡單有效，有效地降低了NK細胞的體外擴增培養成本。在包被步驟中，加入透明質酸，顯著地增加NK細胞的比例和擴增倍數；具有極大的市場前景和經濟價值。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，尤其是涉及一種自然殺傷細胞(NK細胞)的體外培養擴增方法。

背景技術

通常，NK細胞的應用工藝流程，從不同來源的血液采集開始，經歷了血液(如外周血、臍帶血、骨髓)的單個核細胞分離、種瓶包被、激活劑刺激、特異性抗體誘導、大規模擴增培養、NK細胞收獲、質量監控等七個階段，涉及單個核細胞的分離技術、NK細胞的體外誘導和激活技術、NK細胞的體外高效擴增技術、NK細胞的收獲技術、NK細胞的質量控制技術等關鍵工藝技術。其中，NK細胞的體外誘導和大規模高效擴增技術是整個NK細胞制備工藝的基礎和關鍵步驟，很大程度地決定了最終所得NK細胞產品的最終數量、純度和殺傷活性。特別地，如果經體外培養得到的NK細胞的純度較低、含有CD3+陽性的非NK淋巴細胞較多，會嚴重地降低NK細胞的直接殺傷活性及其抗衰老等功效并容易引起主要由T淋巴細胞導致的嚴重的副作用，如高燒、過敏等；此外，如果NK細胞體外培養的數量較少，那么則會大大地增加NK細胞的應用成本。

因此，NK細胞的體外高效活化及擴增技術一直都是本領域的研究熱點。目前，從人外周血中分離人NK細胞的基本方法是：首先，對所獲得的血液樣品進行密度梯度離心，取得白膜層(內含單個核細胞PBMC)；然后，使用0.9％生理鹽水將血樣標本還原至原體積，離心、洗滌，并用無血清培養基將PBMC重懸，調整細胞濃度至適當范圍；接下來，將PBMC重懸液轉入預先包被好的細胞培養瓶中刺激、培養適當時間；最后，轉入細胞培養袋中繼續培養，持續添加含有活性成分的無血清培養基，維持細胞濃度在合適范圍，14天左右后即可得到大量擴增的NK細胞。以上現有技術存在多方面的不足，包括：1)NK細胞的擴增倍數較低，經過兩個星期左右的培養，NK細胞的擴增倍數僅為幾倍至十幾倍；2)所得NK細胞的純度較低，達不到實際應用的要求；3)在培養過程中，大量使用多種價格高昂的細胞因子和抗體，造成NK細胞的制備成本過高，不適合進行NK細胞的大規模體外培養擴增；4)雖然有研究者將K562細胞作為滋養層細胞來培養NK細胞，并獲得了純度較高、數量較多的NK細胞。但是K562細胞是一種白血病細胞，可以釋放大量的含有腫瘤核酸信息的外泌體微囊促使正常的造血細胞惡變，用滋養層細胞培養制備的NK細胞用于臨床治療存在著較高的安全風險，對制備工藝的要求也異常苛刻。故一般不推薦作為臨床級NK細胞大規模培養的常規技術。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于克服現有技術的不足，經過大量的誘導激活劑篩選等實驗研究，尤其是NK細胞的體外活化培養、擴增技術進行了優化，從而找到的一種操作簡便而經濟有效的NK細胞培養擴增技術，具NK細胞得率高、生長狀態好、殺傷活性高、整體工藝成本低特點。

為解決上述技術問題，本發明公開了一種體外高效活化擴增NK細胞的方法，所方法包括如下步驟：

A.激活劑預處理

在培養瓶中加入激活劑和PBS進行混合后，所述激活劑含有0.10mg-100.00mg/ml的透明質酸和0.1μg-20μg/ml的CD16抗體，所述激活劑和所述PBS的體積比為1:40；活化處理，吸除激活劑，然后加入生理鹽水，輕晃培養瓶，最后吸除生理鹽水,得到已包被的培養瓶；

B.單個核細胞分離、血漿采集及處理