[發(fā)明專利]一種牛種布氏菌快速檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711402372.7
• 申請(qǐng)日: 2017-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN108148893A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳義平;秦立得;南文龍;譚鵬飛;鞏明霞;張鳳霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明提供一種牛種布氏菌的RPA快速鑒別檢測(cè)方法，其中所使用的引物組的序列為SEQ ID NO:1?4。本發(fā)明引物組及方法的優(yōu)點(diǎn)如下：1)高效靈敏：30min即可完成擴(kuò)增，擴(kuò)增模板的最低檢出限為1.0×10^?2ng/μl；2)特異性強(qiáng)：采用PRA引物組特異性對(duì)牛種布氏菌進(jìn)行鑒別檢測(cè)，與其他種、生物型的布氏菌、布氏菌疫苗株及常見非布氏菌株，無交叉反應(yīng)；3)操作簡(jiǎn)便：配置好的RPA反應(yīng)體系，置于39℃恒溫條件下完成反應(yīng)，不需要使用PCR儀。4)高通量：可在水浴或恒溫培養(yǎng)箱中一次性進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，不受PCR儀設(shè)備檢測(cè)孔數(shù)量限制。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛種布氏菌快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

布氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布氏菌引起的一種人獸共患病，該病給畜牧業(yè)造成了重大損失，并嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。牛布病通常是由牛種布氏菌引發(fā)的，公牛感染后出現(xiàn)睪丸炎、附睪炎、精囊壞死等多種臨床癥狀，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能；懷孕母牛感染后會(huì)引發(fā)胎盤炎并導(dǎo)致流產(chǎn)，流產(chǎn)率高達(dá)31.2％，牛奶中可帶菌。當(dāng)接觸了牛種布氏菌污染的環(huán)境、患病動(dòng)物及產(chǎn)品后，人類可感染發(fā)病，表現(xiàn)為發(fā)熱、盜汗、全身不適，難以治愈，嚴(yán)重者失去勞動(dòng)能力。因此，實(shí)現(xiàn)牛種布氏菌快速鑒別檢測(cè)，對(duì)該病的診斷及有效防控具有重要意義，可降低該病造成的損失和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。

布氏菌分為羊種布氏菌、牛種布氏菌、豬種布氏菌等9個(gè)種，不同種布氏菌可根據(jù)理化及生物學(xué)特性的不同，通過病原分離鑒定的方法鑒別區(qū)分，但該方法需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)人員和設(shè)備要求較高。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為布氏菌種型的快速鑒別提供了手段，國(guó)際上已先后建立基于PCR和熒光定量PCR方法鑒別牛種布氏菌的方法。RPA是近年一種新開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法能在36～40℃恒溫條件下于20min內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因以完成檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。與常規(guī)的PCR和熒光定量PCR方法相比，PRA技術(shù)反應(yīng)條件為恒溫，不需要進(jìn)行變性、退火、延伸循環(huán)，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備依賴少且反應(yīng)速度快，特別適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前該技術(shù)已經(jīng)在一些病原快速檢測(cè)方面得到應(yīng)用，但還沒有基于RPA技術(shù)鑒別牛種布氏菌的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種牛種布氏菌的RPA快速鑒別檢測(cè)方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一組用于鑒別牛種布氏菌的引物組，所述的引物組的引物信息如下：

Omp2-F:CGTGCGGCATGTAACCGTCGATCGTGTAATC(SEQ ID NO:1)、

Omp2-R:TGCATATATCACGCTTGGTGGTTTCAAGGTT(SEQ ID NO:2)、

Omp31-F:GGTCTCGAAGGCAAAGCTGAAACCAAGGTC(SEQ ID NO:3)、

Omp31-R:GGTATTCCGACTTGAGCGTCCAGTTGTTGT(SEQ ID NO:4)；

本發(fā)明還提供一種利用上述RPA引物組檢測(cè)牛種布氏菌的方法，包括如下步驟：

1)待檢測(cè)基因組DNA的提取：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA；

2)RPA步驟：將本發(fā)明設(shè)計(jì)RPA引物組及各反應(yīng)組分，分別加入反應(yīng)體系中，39℃反應(yīng)30min。

3)結(jié)果檢測(cè)：回收純化RPA反應(yīng)產(chǎn)物，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判定檢測(cè)結(jié)果。

另一方面，本發(fā)明的RPA引物組可用于制備檢測(cè)試劑盒。