[發(fā)明專利]檢測(cè)甲型肝炎和戊型肝炎病毒的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711396720.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-21
• 公開（公告）號(hào): CN108034763B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王雷;林笑冬;張志強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京卓誠(chéng)惠生生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京英創(chuàng)嘉友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超;王浩然

本公開公開了重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測(cè)甲型肝炎和戊型肝炎用引物探針組和試劑盒及檢測(cè)方法，包括具有SEQ ID NO.1?4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.5?6所示核苷酸序列的探針。本公開還提供了一種重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測(cè)甲型肝炎和戊型肝炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包括本公開所述的引物探針組。通過(guò)上述技術(shù)方案本公開顯著地提高了對(duì)甲型肝炎和戊型肝炎病毒檢測(cè)的敏感性、特異性和簡(jiǎn)便性。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測(cè)甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探針組及試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

肝炎是在世界范圍內(nèi)廣泛流行的嚴(yán)重危害人體健康甚至生命的嚴(yán)重疾病，目前主要分為甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎。根據(jù)傳播途徑可將其分為兩大類，其中乙型、丙型、丁型、庚型肝炎的主要傳播途徑為血液傳播、醫(yī)源性傳播、母嬰傳播、性傳播，其中血液傳播和性傳播為最常見途徑。而甲型和戊型肝炎的主要通過(guò)糞-口途徑傳播，多為大范圍的急性傳染病。

甲肝、戊肝病毒在環(huán)境和食物中能長(zhǎng)期存活，但卻不能復(fù)制，在被污染的環(huán)境和食物中的病毒含量比較低(5-100感染顆粒)，傳播無(wú)規(guī)律性。因此鑒定甲型、戊型肝炎暴發(fā)的病毒來(lái)源會(huì)有比較大的困難。即使人體攝入低劑量的病毒也可能導(dǎo)致人類疾病，嚴(yán)重危害人類健康。

目前國(guó)內(nèi)外均建立了采用PCR技術(shù)對(duì)甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的方法。但是常規(guī)PCR檢測(cè)需要精密的儀器以及繁瑣的試驗(yàn)程序，且耗時(shí)較長(zhǎng)，難以滿足非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)與傳統(tǒng)PCR相比核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要昂貴的PCR儀，可在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增出目的片段，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。但LAMP檢測(cè)RNA樣本需要設(shè)置單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄步驟，60-90min才可以完成反應(yīng)，且對(duì)SNP識(shí)別度不夠，引物結(jié)合區(qū)域單位點(diǎn)突變不能被LAMP識(shí)別。LAMP采用65℃恒溫?cái)U(kuò)增，若待檢測(cè)區(qū)域的GC含量過(guò)低、過(guò)高或者二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，則擴(kuò)增效果較差。且LAMP采用多組引物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)物量巨大，極易污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。

隨著全世界范圍的人口數(shù)量增加及流動(dòng)逐漸頻繁，甲肝、戊肝在世界各國(guó)的短時(shí)間內(nèi)的大流行、大爆發(fā)將更加頻繁。因此，針對(duì)疫情的快速暴發(fā)、傳播范圍廣的特點(diǎn)，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單方便、器材要求不高的甲型肝炎和戊型肝炎病毒檢測(cè)技術(shù)，對(duì)病例的快速識(shí)別和疫情的傳播控制具有非常重要意義。對(duì)公共衛(wèi)生和食品安全方面防控具有重要的價(jià)值意義。

發(fā)明內(nèi)容

本公開的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中不能對(duì)甲型肝炎和戊型肝炎進(jìn)行快速、靈敏和特異的檢測(cè)的缺陷，提供一種甲型肝炎和戊型肝炎病毒的檢測(cè)引物探針和試劑盒，并建立一種基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)的甲型肝炎和戊型肝炎病毒的快速、靈敏、特異，簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本公開的第一個(gè)方面提供重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測(cè)甲型肝炎和戊型肝炎病毒用引物探針組，其中，包括具有SEQ ID NO.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.5-6所示核苷酸序列的探針；

其中，SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位堿基標(biāo)記有FAM發(fā)光基團(tuán)，第32位堿基后連接脫堿基位點(diǎn)，第34位堿基標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ1；SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位堿基標(biāo)記有VIC發(fā)光基團(tuán)，第32位堿基后連接脫堿基位點(diǎn)，第34位堿基標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ1。

可選的，還包括具有SEQ ID NO.7-8所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ IDNO.9所示核苷酸序列的探針；其中，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第19位堿基標(biāo)記有CY5發(fā)光基團(tuán)，第22位堿基后連接脫堿基位點(diǎn)，第25位堿基標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ3，3’末端標(biāo)記有磷酸鹽基團(tuán)。