[發明專利]一種磷酸化肽段富集試劑盒及富集方法

有效

• 申請號: 201711395960.2
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN108132180B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 阮宏強;陳薇
• 申請（專利權）人: 上海中科新生命生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40;G01N30/08;G01N33/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 肖平安

本發明提供一種磷酸化肽段富集試劑盒及其富集方法，屬于蛋白質肽段富集技術領域，其通過二氧化鈦填料高度特異性地結合肽段上磷酸化基團的特性對蛋白質酶解產物中的磷酸化肽段進行富集，同時優化實驗條件和緩沖試劑，能夠快速地實現大規模的磷酸化肽段富集，它具有檢測靈敏度較高，特異性較強，數據分析結果準確等優點，該試劑盒可廣泛適用于蛋白質及多肽類的磷酸化修飾位點確證。

技術領域

本發明屬于蛋白質肽段富集技術領域，尤其涉及一種磷酸化肽段富集試劑盒，還涉及一種磷酸化肽段富集方法。

背景技術

蛋白質磷酸化是生物界中最為普遍也是非常重要的一種蛋白質修飾類型，在細胞內，大約有三分之一的蛋白質被認為有磷酸化修飾，蛋白質的磷酸化修飾幾乎調節著生命活動的整個過程，包括DNA損傷修復、轉錄調節、信號轉導、細胞凋亡的調節等。磷酸化蛋白質及多肽的研究可幫助我們闡明上述過程的機理，進一步理解生命系統如何在分子水平進行調控，從而認識生命的本質，在對磷酸化蛋白質或者多肽進行研究前必須先對研究對象進行富集，以提高研究的準確性。

當前磷酸化富集的手段有很多種，其中最主要的方法包括使用磷酸化抗體的免疫親和色譜、離子交換色譜分離磷酸化與非磷酸化肽段、固相金屬親和色譜（immobilizedmetal affinity chromatography, IMAC）和金屬氧化物親和富集技術等。

但磷酸化抗體的免疫親和色譜由于抗磷酸化抗體的抗原決定簇較小，所以令抗原抗體的結合位點存在空間障礙，特異性較差；離子交換色譜分離磷酸化與非磷酸化肽段在磷酸化肽所帶電荷較多時會造成部分磷酸化肽的丟失；固相金屬親和色譜可能丟失一些與IMAC柱結合能力較弱的磷酸肽或某些因有多個磷酸化位點而難以洗脫的磷酸肽，同時，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段與固相金屬離子也有結合能力，也可能被富集，影響富集質量。

發明內容

基于現有技術存在上述問題，本發明提供一種磷酸化肽段富集試劑盒及其富集方法，其通過二氧化鈦填料高度特異性地結合肽段上磷酸化基團的特性對蛋白質酶解產物中的磷酸化肽段進行富集，同時優化實驗條件和緩沖試劑，能夠快速地實現大規模的磷酸化肽段富集，它具有檢測靈敏度較高，特異性較強，數據分析結果準確等優點，該試劑盒可廣泛適用于蛋白質及多肽類的磷酸化修飾位點確證。

本發明通過以下詳細技術方案達到目的：

一種磷酸化肽段富集試劑盒，其包括分離柱Tip Column、洗脫液Wash Buffer A、洗脫液Wash Buffer B、洗脫液Elution Buffer C，所述的分離柱Tip Column是使用C18填料為堵頭的自填柱；所述的洗脫液Wash Buffer A包括75-85%乙腈、4-6%三氟乙酸和12-18%水，所述的洗脫液Wash Buffer B包括75-85%乙腈、0.05-0.15%三氟乙酸和18-21%水；所述的洗脫液Elution Buffer C包括75-85%乙腈、2-4%氨水和15-19%水；所述的試劑盒的使用方法包括如下步驟：

步驟S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g 的2,5-二羥基苯甲酸的試管中，震蕩混勻，充分溶解2,5-二羥基苯甲酸，得到含有2,5-二羥基苯甲酸的Wash Buffer A，備用；

步驟S20往含有200-400μg的二氧化鈦填料的試管中加入Elution Buffer C，Elution Buffer C浸沒二氧化鈦填料，震蕩混勻，使用離心力4000-6000g離心45-75s，棄上清液，再加入步驟S10制成的含2,5-二羥基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸沒二氧化鈦填料，混合均勻，使用離心力4000-6000g離心45-75s，棄上清液，重復多次加入含2,5-二羥基苯甲酸的Wash buffer A混勻和離心；