[發明專利]一種基于SEM下管狀分子特征的三葉木通易混淆品種的鑒定方法

在審

• 申請號: 201711393526.0
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN107941833A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 張小卉
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: G01N23/2202
• 分類號: G01N23/2202
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 王霞

技術領域

本發明屬于中藥材鑒定技術領域，涉及三葉木通及其易混淆品種的鑒定方法，具體涉及一種基于SEM下管狀分子特征的三葉木通易混淆品種的鑒定方法。

背景技術

中藥木通來源于木通科木通屬植物三葉木通和白木通的根、莖，具有活血止痛、清熱利尿的功能。傳統中藥木通又稱木通，收載于《中國藥典》。但在用藥歷史上，由于木通資源緊缺，該屬植物屬歷史性混用，曾出現木通混用現象，有馬兜鈴科的關木通、毛茛科的川木通，其中馬兜鈴科的關木通危害最大，會導致嚴重的腎功能衰竭、尿毒癥，嚴重危及患者的健康和生命，我國在2003年就明令禁止使用關木通。其它代用如馬兜鈴科的大葉馬兜鈴、淮通馬兜鈴以及毛茛科小木通和繡球藤由于危害較輕，并未引起足夠重視。對于混用的原因，主要是由于：1.資源緊缺；2.基礎研究薄弱(不認識、分類亂、成分不清楚)。因此，對傳統中藥木通進行全面細致的生物學分析迫在眉睫，有望徹底解決歷史遺留性混用和代用問題。

木通傳統的鑒定方法主要是根據其莖的形態(如斷面粗糙特征，導管直徑)和粉末顏色(棕色)(中華人民共和國藥典，2010版)，但是由于沒有詳細而客觀的標準，導致鑒定不準確或錯誤。近年來較新的鑒定方法如DNA條形碼、分子標記、色譜法等方法來鑒定，DNA條形碼和分子標記法費用高、周期長、數據分析復雜，增加了鑒定的難度和成本。色譜法由于不同地域、不同生長期以及不同器官的有效藥用成分存在差異，比較和篩選難以確定統一的標準。

發明內容

為了克服上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種基于SEM下管狀分子特征的三葉木通易混淆品種的鑒定方法，該方法快速、精準，對設備要求低，操作容易。

本發明是通過以下技術方案來實現：

本發明公開的一種基于SEM下管狀分子特征的三葉木通易混淆品種的鑒定方法，包括以下步驟：

1)將待鑒別的藥材木通藤莖切細段浸泡于乙醇溶液中進行固定，然后采用鉻酸-硝酸離析法進行離析處理；

2)將經步驟1)處理后的藥材洗滌、離心，取沉淀物，將沉淀物浸沒于乙醇溶液中制成懸浮液，保存備用；

3)制備臨時裝片；

4)將經步驟3)制好的臨時裝片染色處理后，在SEM下觀察，并拍照記錄藥材的管狀分子穿孔板類型、紋孔膜特征、導管紋孔試樣及口徑長度；

5)當觀察結果滿足：

第一，95％以上的導管端壁為單穿孔板類型，5％的為梯狀穿孔板，端壁穿孔板具有短喙；

第二，若側壁穿孔板為梯狀，其端壁為單穿孔平截無尾；

第三，紋孔膜僅出現在管胞狀導管的端壁；

第四，導管的紋孔式樣為互列式；

第五，口徑長度為30～60μm；

則判斷該藥材為三葉木通。

優選地，步驟1)中，所述固定是將木通藤莖切成長度為0.8～2cm的小段，浸入濃度為70％的乙醇溶液中固定40～60h。

優選地，步驟1)中，所述離析處理是將固定后的材料浸入離析液中，在40～50℃的恒溫箱中離析處理24～48h。

優選地，所述離析液由質量濃度為10％的硝酸溶液和質量濃度為10％的鉻酸溶液等體積混合配制而成；加入的離析液的質量為材料的15～20倍。

優選地，步驟2)中，洗滌是用蒸餾水洗滌；離心是在6000～8000rpm下處理8～12min。

優選地，步驟2)中，將離心后的沉淀物浸沒于質量分數為50％的乙醇溶液中。

優選地，步驟2)中，制得的懸浮液保存時間長達6個月。

優選地，步驟3)中，臨時裝片是吸取1～2滴懸浮液滴于潔凈的載玻片上，滴入蒸餾水涂抹均勻，蓋上蓋玻片，陰干48h。

優選地，步驟4)中，采用5％的番紅溶液進行染色。

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：

本發明利用掃描電鏡(SEM)技術，根據不同物種的藥材藤莖的導管分子微特征，如紋孔膜，紋孔式樣，穿孔板類型，不同穿孔板的導管分子比例等，來精準鑒別藥材。三葉木通莖的顯微特征為：(1)95％的導管多為單穿孔板類型，且端壁穿孔板具有短喙，僅5％的類型為梯狀穿孔板；(2)無紋孔膜，或僅出現在管胞狀細長導管的端壁；(3)導管側壁的穿孔板為梯狀、紋孔式樣為互列式；(4)導管大小長度約100-300μm、口徑約30-60μm。本發明方法能夠快速、準確的鑒別出木通科的三葉木通與毛茛科的川木通、馬兜鈴科的關木通，該方法的意義在于能夠在此基礎上建立常用木通藥材微形態學鑒定的指導性標準。

附圖說明