[發明專利]酶解法提取及培養人臍帶間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201711386935.8
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108165526A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 姚玲玲;孟得龍;楊苗;宋丹;劉得娟
• 申請（專利權）人: 北京煥生匯生物技術研究院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 魏秀枝

本發明公開了酶解法提取及培養人臍帶間充質干細胞的方法，包括以下步驟：先取臍帶組織，然后分離出華通氏膠，接下來將華通氏膠切割成組織勻漿并轉入離心管中，按體積比1：1的比例加入預溫的0.1％膠原酶I，放入到CO₂培養箱中在37℃條件下進行恒溫酶解，每隔20min劇烈震蕩一次，當組織塊已被酶解成糊狀時停止酶解，抽取酶解液貼著400目細胞篩進行過濾，向濾液中補加PBS重懸細胞，離心去上清，再用PBS重懸細胞并離心洗滌，最后用細胞培養液將細胞重懸并轉移至T75培養瓶中培養。本發明的有益之處在于：采用較低濃度(0.1％)的膠原酶I進行酶解，不僅減小了對細胞的損傷，同時降低了提取及培養的成本。

技術領域

本發明涉及提取及培養細胞的方法，具體涉及酶解法提取及培養人臍帶間充質干細胞的方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是具有自我更新、多向分化、多方向分化潛能、造血支持以及免疫調控等特性的細胞。MSC在連續傳代培養和冷凍保存后，仍有多向分化潛能，因此可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷的修復。MSC能分泌產生多種促進生長分化的細胞因子，例如：HGF、IL-6、IGF-1、TGF-α、TGF-β、BDNF、EGF、FGF、SDF-1、和VEGF等，具有免于調控功能。因此，MSC在再生醫學領域有重要作用。

MSC最初是在骨髓中發現的，后來發現臍帶、臍血、胎盤和其他一些組織中也存在。臍帶間充質干細胞(UCMSC)是存在于臍帶華爾通膠(Wharton'sjelly)和血管周圍組織中的一種干細胞。來源于臍帶的間充質干細胞具有取材方便、來源豐富、易于采集和運輸、生物學特性穩定、免疫原性低、無異體排斥反應、成本低、對捐獻者無損害及不涉及倫理問題等優勢，所以在未來醫療應用方面具有很大的潛力。

目前，UCMSC的原代分離方法主要有：組織塊培養法、酶解法。

組織塊培養法的培養周期長，從而加大了培養過程中污染的幾率，并且加大了成本。此外，組織塊培養法占用空間大，不適于大規模批量化的生產。

酶解法的培養周期短，占用空間小，適用于大規模培養。

但是，現在多數酶解法都是采用較高濃度(0.2％～1％)的膠原酶進行酶解，或者采用膠原酶與胰酶聯合進行酶解，都對細胞有損傷。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可減小細胞損傷的提取及培養人臍帶間充質干細胞的方法。

為了實現上述目標，本發明采用如下的技術方案：

酶解法提取及培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：取健康產婦39周～40周正常分娩或剖腹產臍帶組織；

Step2：從臍帶組織中分離出華通氏膠；

Step3：將華通氏膠置于培養皿中，切割成組織勻漿，然后轉入離心管中，按體積比1：1的比例加入預溫的0.1％膠原酶I，放入到CO₂培養箱中在37℃條件下進行恒溫酶解，每隔20min劇烈震蕩一次，酶解2h左右觀察酶解效果，當組織塊已被酶解成糊狀時停止酶解，用注射器抽取酶解液貼著400目細胞篩進行過濾，向濾液中補加PBS重懸細胞，300G離心5min，去掉上清，再次用PBS重懸細胞并離心洗滌，最后用細胞培養液將細胞重懸并轉移至T75培養瓶中；

Step4：將裝有UCMSC的T75培養瓶放置于CO₂培養箱中，在37℃條件下恒溫培養，每天觀察UCMSC的生長情況，當細胞融合度達到80％時，執行P0～P1傳代操作；