[發(fā)明專利]一種制備具有確定15N豐度的N2O及基于15N同位素示蹤法測量氮循環(huán)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711385580.0
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108300666B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李雅穎;鄭寧國;姚槐應;吳愉萍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院寧波城市環(huán)境觀測研究站;中國科學院城市環(huán)境研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/04;G01N27/62;C12R1/80
• 代理公司: 浙江中桓聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33255
• 代理人: 王正偉

本發(fā)明涉及一種利用微紫青霉菌制備具有確定¹⁵N豐度的N₂O及基于¹⁵N同位素示蹤法測量氮循環(huán)的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的微紫青霉菌已于2017年8月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCCNo.14146，具有確定¹⁵N豐度的N₂O的制備方法包括如下步驟：采集土壤樣品，稀釋后進行菌株的培養(yǎng)、測氣篩選和鑒定；使用具有確定¹⁵N豐度的NaNO₃配置察氏液體培養(yǎng)基，并接種微紫青霉菌菌株，振蕩培養(yǎng)后收集產(chǎn)生的N₂O，加入堿液吸收除去其中的CO₂，即得到具有確定¹⁵N豐度的N₂O。本發(fā)明的方法產(chǎn)氣快速、準確，且操作簡便、成本低；制得的氣體作為標準氣體用于氮素循環(huán)的研究，結(jié)果準確度和精確度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用微紫青霉菌制備具有確定¹⁵N豐度的N₂O及基于¹⁵N同位素示蹤法測量氮循環(huán)的方法。

背景技術(shù)

¹⁵N同位素示蹤技術(shù)是我們開展氮素循環(huán)的研究最有效方法，它能區(qū)分氮素各周轉(zhuǎn)過程(礦化、硝化、反硝化等)的速率和通量。目前對于¹⁵NO₃^--N和¹⁵NO₂^--N的檢測，是通過添加化學試劑(如鹽酸羥胺)，將硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮還原成¹⁵N₂O氣體進行測定。在此方法中，需要用標準的¹⁵N₂O氣體進行校準。而目前¹⁵N₂O的制備方法主要是將以¹⁵N標記的亞硝酸鹽為原料通過化學還原反應生成。但是此方法存在較大問題：一是亞硝酸鹽不穩(wěn)定，儲存過程中極易被氧化成硝酸鹽，影響¹⁵N₂O的含量及豐度；二是產(chǎn)生的¹⁵N₂O氣體不易保存，只能現(xiàn)配現(xiàn)用。

通過微生物的反硝化作用也可以產(chǎn)生N₂O，長期以來，人類一直認為只有細菌才能進行反硝化反應，細菌反硝化作用的產(chǎn)物主要是N₂，然而在1972年，人類首次發(fā)現(xiàn)擔子菌門和子囊菌門中也存在反硝化活性，還發(fā)現(xiàn)一些以前被認為嚴格好氧的尖孢鐮刀菌等多種真菌也能進行反硝化作用。真菌是一種真核生物，與細菌相比具有更為復雜的結(jié)構(gòu)，是土壤氮循環(huán)過程中的重要參與者之一。相比細菌的反硝化作用，這些真菌的獨特之處就在于真菌中存在P450(細胞色素P450，一氧化氮還原酶)，可利用NADH(還原性輔酶I)或NADPH(還原性輔酶II)作為直接電子供體將NO還原為N₂O。目前關(guān)于真菌反硝化作用的研究多集中于真菌對土壤N₂O釋放的貢獻，還未見有利用真菌生產(chǎn)制備具有確定豐度的¹⁵N₂O的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提出了一種利用微紫青霉菌，通過添加具有確定¹⁵N豐度的NaNO₃為底物，從而快速、準確的制備具有確定¹⁵N豐度的N₂O氣體，操作簡便，成本經(jīng)濟。

本發(fā)明的目的可通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株，已于2017年8月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCC No.14146(保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，電話：[phone]，電子郵件：[e-mail])。