[發明專利]蔬菜中腸出血性大腸埃希氏菌的PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201711384960.2
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108179204A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 羅雁非;聶丹丹;丁旭;王準;肖建光;曲輝;吳連鵬;孫玉;彭勃
• 申請（專利權）人: 吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

本發明公開了一種蔬菜中腸出血性大腸埃希氏菌PCR檢測方法，尤其涉及一種優化的微滴數字PCR檢測反應體系。所述的微滴數字PCR檢測方法包括以下步驟：a.制備樣品和增菌培養；b.提取細菌模板DNA；c.以提取的DNA為模板，加入上述的引物和帶熒光染料的探針以及酶反應液進行實時熒光PCR反應，所述的反應結束后，檢測所有微滴的熒光信號值并設定閾值，根據熒光信號的閾值確定微滴是否包裹模板DNA，高于閾值的微滴包裹模板DNA，為陽性微滴，低于閾值的微滴不包裹模板DNA為陰性微滴，本發明提供的檢測方法工作流程簡單，又兼具實時熒光定量PCR方法的優點，可實現核酸絕對定量分析，并且又具有高通量樣品處理能力，實用性強。

技術領域

本發明屬食品衛生檢測技術領域，具體涉及一種蔬菜中腸出血性大腸埃希氏菌O_157:H₇的微滴數字PCR檢測方法。

背景技術

腸出血性大腸埃希菌（enterohemorrhage E．Coli，EHEC）是大腸埃希氏菌的一個亞型，EHEC的主要致病機制是產生的毒素能使 vero 細胞產生病變，故稱 vero 毒素。又因與志賀氏菌的毒素在生物學特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦稱志賀氏樣毒素（SLT）或志賀氏毒素Stx。其中腸出血性大腸埃希菌O₁₅₇:H₇是主要的致病菌株。自1982年美國從出血性腸炎患者糞便中分離出腸出血性大腸埃希氏菌O₁₅₇:H₇至今，腸出血性大腸埃希菌 O₁₅₇:H₇感染的爆發及散發疫情已遍布6大洲30多個國家。中國于1986年首次從江蘇省徐州市腹瀉病患者糞便標本中分離到腸出血性大腸埃希氏菌O₁₅₇:H₇，1999-2000年安徽、江蘇、河南等地發生腸出血性大腸埃希菌O₁₅₇:H₇感染性腹瀉的大規模爆發流行。

目前國內外鑒別腸出血性大腸埃希氏菌O₁₅₇:H₇的方法可分為傳統方法、免疫方法和分子檢測方法，傳統的分離培養法和生化鑒定時間長，靈敏度低；與之相較，免疫學方法縮短了檢測時間，但是容易發生腸出血性大腸埃希菌的多種血清型的交叉反應；隨著聚合酶鏈式反應（PCR）方法的發展，實時熒光定量PCR技術已成功用于腸出血性大腸埃希氏菌O₁₅₇:H₇的檢測中，具有特異性強、靈敏度高和快速等優點。

微滴數字PCR方法（Droplet digital PCR, dd PCR）是近年來在PCR技術基礎上發展起來的另一種快速、準確、可實現DNA絕對定量一種PCR方法。在鑒別腸出血性大腸埃希氏菌O₁₅₇:H₇的工作中，微滴數字PCR檢測方法是前沿的技術手段，也是最精確和最敏感的檢測方法。其原理是將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，再進行PCR反應；因為在制作微滴時，只有部分微滴可包裹到目的基因，所以PCR反應結束后檢測所有微滴的熒光信號值，判斷陽性微滴即包裹到目的基因的微滴，再根據泊松分布計算目的基因拷貝數。與實時熒光定量PCR方法相比，本方法無需根據外部核酸標準品，無需標準曲線，工作流程簡單，又兼具實時熒光定量PCR方法的優點，可實現核酸絕對定量分析，并且又具有高通量樣品處理能力，實用性強。